钝顶螺旋藻干粉叶绿素a 提取方法探讨

付丽丽，金晶，吉美萍，那日，郭九峰

(内蒙古大学 自治区离子束生物工程重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010021)

螺旋藻(Spirulina platensis)属于原核藻类，表现为丝状体，含有藻胆蛋白、叶绿素a、胡萝卜素以及多糖等多种有效成分［1-3］。因其中丰富而均衡的营养，被誉为“人类明天最理想的食品”［4］。在螺旋藻的有机干重中，叶绿素a 占有一定的比例，在1% ～2%，因此叶绿素a 则可以作为衡量螺旋藻生物量的重要指标［5］。

提取螺旋藻叶绿素a 通常采用有机溶剂提取法、超临界萃取和超声提取法等。有机溶剂提取法提取率低，超临界萃取法成本高等，超声提取法具有提取率较高、成本低、耗时短等优点。

本文以固液比、超声功率、超声时间为因素，对超声法提取钝顶螺旋藻叶绿素a 进行探讨，确立了优化条件。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

钝顶螺旋藻，本实验室培养;乙醇、丙酮均为分析纯。

ISO 9001 电子天平;KQ-100DE 数控超声波清洗器;HITACHI U-2900 IV/VIS 紫外分光光度计。

1.2 实验方法

称取钝顶螺旋藻干粉0.020 g 于30 mL 离心管中，加入提取剂10 mL，于棕色瓶中室温浸提12 h，过滤，得上清液。

吸取一定量的叶绿素a 提取液，用紫外分光光度计测量A663、A645、A750的值。通过以下公式分别计算出叶绿素a 的浓度及其提取率。

叶绿素a 浓度(mg/L)C =12.7(A663－A750)－2.69(A645－A750)

叶绿素a 提取率(%)Y=(CV/m)×100%

式中 A663、A645、A750——叶绿素a 提取液在663，645，750 nm 处的吸光值;

C——叶绿素a 浓度，mg/L;

V——提取液体积，L;

m——螺旋藻干粉质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

A(90% 乙醇)、B(90% 丙酮)、C(90% 乙醇-90%丙酮)(1∶1)、D(90%乙醇-90%丙酮)(1∶2)、E(90%乙醇-90%丙酮)(2∶1)对钝顶螺旋藻干粉叶绿素a 提取率的影响见图1。

图1 提取剂对叶绿素a 提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of chlorophyll a

由图1 可知，90%乙醇-90%丙酮(1∶1)的叶绿素a 的提取率最高，其值为1.358%;不同试剂浸提钝顶螺旋藻叶绿素a 的提取率依次为90%乙醇-90%丙酮(1∶1)＞90%乙醇-90%丙酮(1∶2)＞90%乙醇-90%丙酮(2∶1)＞90%乙醇＞90%丙酮。表明，两种试剂混合的浸提效果好于单一试剂，且90%乙醇-90%丙酮(1∶1)的浸提效果最好，选为超声法提取钝顶螺旋藻叶绿素a 的提取剂。

2.2 单因素实验

2.2.1 固液比对提取率的影响 称取0.020 g 的

钝顶螺旋藻干粉于离心管中，加入90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超声功率60%，超声时间20 min，固液比对叶绿素a 提取率的影响见图2。

图2 固液比对叶绿素a 提取率的影响Fig.2 Effect of extraction solid of liquid to ratio on extraction yield of chlorophyll a

由图2 可知，随着固液比的增大，叶绿素a 提取率先增大后减小。当固液比为1∶500(g/mL)时，叶绿素a 提取率最高，达到1.448%。因此，最佳固液比为1∶500(g/mL)。

2.2.2 超声功率对提取率的影响 称取0.020 g的钝顶螺旋藻干粉于离心管中，加入10 mL 90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超声时间20 min。超声功率对叶绿素a 提取率的影响见图3。

图3 超声功率对叶绿素a 提取率的影响Fig.3 Effect of extraction ultrasonic power on extraction yield of chlorophyll a

由图3 可知，随着超声功率的增大，叶绿素a 提取率先增大后减小，当超声功率为80%时，叶绿素a提取率最高为1.479%。

2.2.3 超声时间对提取率的影响 称取0.020 g的钝顶螺旋藻干粉于离心管中，加入10 mL 90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超声功率60%，超声时间对叶绿素a 提取率的影响见图4。

图4 超声时间对叶绿素a 提取率的影响Fig.4 Effect of extraction ultrasonic time on extraction yield of chlorophyll a

由图4 可知，随着超声时间的增加，叶绿素a 提取率先增加后减小，当时间为20 min 时效果最佳，叶绿素a 提取率达到1.419%。

2.3 正交实验结果

以单因素实验为基础，进行正交实验［6-7］，考察固液比、超声功率、超声时间对钝顶螺旋藻干粉叶绿素a 提取率的影响。因素与水平见表1，结果见表2。

由表2 可知，各因素对提取率的影响依次为超声功率＞固液比 ＞超声时间，最优组合为B2A2C3，即超声功率80%，固液比1∶500(g/mL)，超声时间20 min 时，叶绿素a 提取率最高，达到1.545%。

表1 因素水平表Table 1 Factor and level table

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可知，超声功率对提取率的影响极显著(P ＜0. 01)，固液比对提取率的影响显著(P ＜0.05)，超声时间无显著性影响。

有报道［8］采用响应面法优化螺旋藻中叶绿素的超声提取工艺中，叶绿素提取率为1.280%。可看出，本实验采用的优化条件得到的结果比此报道中的叶绿素提取率高出20. 7%，达到了较好的效果，该方法不但提取率高，且成本低、耗时短，可作为提取钝顶螺旋藻叶绿素a 的一种有效方法。

3 结论

超声法提取钝顶螺旋藻干粉叶绿素a 的最优条件为:固液比1∶500(g/mL)，超声功率80%，超声时间20 min。该条件下，钝顶螺旋藻叶绿素a 的提取率达1.545%。其中超声功率对a 提取率的影响极显著，固液比对提取率的影响显著。

［1］ Wang L，Pan B，Sheng H，et al.Antioxidant activity of Spirulina platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction［J］.Food Chemistry，2007，105(1):36-41.

［2］ Patil G，Chethana S，Madhusudhan M C，et al.Fractionation and purification of the phycobiliproteins from Spirulina platensis［J］.Bioresource Technology，2008，99(15):7393-7396.

［3］ Muhling M，Belay A，Whitton B A.Variation in fatty acid composition of Arthrospira (Spirulina)strains［J］. Journal of Applied Phycology，2005，17(2):137-146.

［4］ 周志刚，尹长松.富硒极大螺旋藻整细胞、藻胆体及藻蓝蛋白的光谱特性［J］.上海水产大学学报，2002(3):208-214.

［5］ 戴荣继，黄春，佟斌，等. 藻类叶绿素及其降解产物的测定方法［J］. 中央民族大学学报:自然科学版，2004(1):75-80.

［6］ 周晓光，李为民，陈刚，等. 一种近正交实验设计方法［J］. 空军工程大学学报:自然科学版，2010(3):84-88.

［7］ 彭海滨.正交实验设计与数据分析方法［J］.计量与测试技术，2009(12):39-40.

［8］ 童洋，肖国民，潘晓梅.响应面法优化螺旋藻中叶绿素的超声提取工艺［J］.化工学报，2009(11):2813-2819.