根际浇灌ALA 溶液对苹果叶片生理特性与果实品质的影响

张丽颖， 冯新新， 高晶晶， 安玉艳， 田 凡， 李 洁， 张治平， 汪良驹

(1.南京农业大学园艺学院，江苏 南京210095;2.江苏省丰县临风果蔬专业合作社，江苏 徐州221723)

改善果实品质始终是果树生产科研中的重大课题，任何能够提高果实品质的技术措施都具有实践意义和科学意义。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一种普遍存在于动植物及微生物体内的天然物质，是所有卟啉化合物包括叶绿素、亚铁血红素、光敏素发色团等生物合成的关键前体［1］。大量研究结果表明，ALA 可诱导植物组织再生［2］，促进种子萌发［3］，提高叶片光合效率［4］，促进氮素吸收与转化［5］，促进果实着色［6］，增强植物抵抗低温［7］、弱光［8］、盐渍［9］和干旱［10］等逆境的能力，因而，被认为是一种新的植物生长调节物质［11］。在苹果上，汪良驹等［12］最早报道300 mg/L ALA 可以促进果实花青苷合成，提高果实外观品质。王中华等［6］证实了这一效应，并且认为它与苯丙氨酸解氨酸(PAL)活性上调有关。Xie 等［13］证明，ALA 可以诱导苹果果皮中与花青苷合成有关的多种基因的表达，从而促进花青苷积累。高晶晶等［14］提出，利用低浓度ALA 溶液进行叶面喷施，在提高叶片光合性能的同时改善了果实品质。但是，ALA 对光照敏感，如果白天喷施，很可能因为光照而影响到ALA 活性。因而，改进ALA 的施用方法仍然是这种天然植物生长调节剂实际生产推广的重要前提。本研究以秦阳苹果为材料，通过根际浇灌0.1 ～10 mg/L ALA 溶液，比较不同处理对苹果叶片叶绿素含量、叶绿素荧光特性、抗氧化活性、脂质过氧化水平以及果实采收品质的影响，以期为ALA 在苹果生产上推广应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与处理

试验于2013 年4 月下旬至2013 年7 月下旬在江苏省丰县赵庄镇田坑村优质苹果密植示范园内进行。供试苹果树4 年生(试验时为结果后第2 年)，品种为秦阳，株行距2 m ×4 m，砧木为八棱海棠。试验设0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L 3 个ALA 浓度，以清水为对照，单株小区，重复5 次，随机排列。每个小区之间均间隔1 株作为保护区。4 月底(谢花后)开始处理，以后每1 个月(即5 月底和6 月底)再施1 次，共计3 次。ALA 处理前，先将ALA(苏州益安生物科技有限公司生产)配成母液，然后稀释至指定浓度，浇灌于苹果树盘内，每株10 kg。处理结束后1 个月(7 月底，正值果实成熟)，选取树冠外围新梢中上部成熟叶片，活体测定叶绿素荧光特性。选取类似部位叶样，用冰盒保存，尽快带回室内，并分为3 组，1 组测定叶绿素含量，1 组液氮速冻，保存于－80 ℃，用于抗氧化酶活性、膜脂过氧化水平测定，第3 组经110 ℃杀青15 min，80 ℃烘至恒质量，用于矿质元素测定。同时，随机采集各处理成熟果实(各100 个)，分析果实品质。

1.2 生理生化指标测定

叶绿素快速荧光特性测定采用英国Hansatech公司生产的多功能植物效率仪(M-PEA)，并按照Srivastava 等［15］和孙永平等［16］的方法进行JIP-test 分析。每个处理重复测定10 ～15 张叶片，取平均值。

叶片叶绿素含量测定采用95%酒精浸提法［17］，叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法［18］测定，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性按Change 和Maehly 法［19］测定，抗坏血酸过氧化酶(APX)活性按Mishra 法［20］测定，超氧阴离子生成速率用羟胺法［21］测定，过氧化氢(H2O2)含量按Jana 等法［22］测定，丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸法［23］测定，果皮花青素含量用盐酸甲醇法［24］测定，可溶性固形物含量用PAL-1 手持型折光仪测定，可溶性糖用蒽酮法［25］测定，可溶性蛋白用考马斯亮蓝法［26］测定，VC含量用紫外分光光度法［27］测定，可滴定酸含量用NaOH 滴定法测定。叶片矿质营养元素包括K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn 和Na 等含量用电感耦合等离子体原子发射光谱法［28］测定，磷含量用钼蓝比色法［29］测定。以上测定，均重复4 次以上，取平均值，并进行方差分析和Duncan’s 测验。

2 结果与分析

2.1 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片叶绿素含量的影响

根际浇灌ALA 溶液可以提高秦阳苹果叶片叶绿素含量(图1)，其中，0.1 mg/L ALA 处理叶片Chl.a、Chl.b、叶绿素总量和Chl.b/Chl.a 的苹果与对照差异均不显著，而1.0 和10 .0 mg/L ALA 处理叶片的Chl. a、Chl. b、叶绿素总量和Chl. b/Chl. a 比值均显著高于对照(P ＜0.05)。1.0 mg/L ALA 处理的叶片叶绿素a 比对照高出5%，叶绿素b 高出41%，叶绿素总量高出17%，Chl. b/Chl. a 高出35%。说明，根际浇灌ALA 溶液可以显著促进苹果叶片叶绿素特别是叶绿素b 的积累。

图1 根际浇灌不同浓度ALA 溶液对秦阳苹果叶片叶绿素a(A)、叶绿素b(B)、叶绿素总量(C)以及Chl.b/ Chl.a(D)的影响Fig.1 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the leaf chlorophyll a (A)，chlorophyll b (B)，total chlorophylls (C)and chlorophyll b/a in Qinyang apple trees

2.2 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片叶绿素荧光特性的影响

图2A 为ALA 处理后苹果叶片叶绿素快速荧光诱导动力学曲线，即OJIP 曲线，其中，O 相为照光后50 μs 的瞬时荧光值，J 相为2 ms 的瞬时荧光值，I相为30 ms 的瞬时荧光值，P 相为在200 ms 左右的的瞬时荧光值。从图2A 中可以看出，ALA 处理后的OJIP 荧光值普遍高于对照，而且浓度越高，荧光值越高，说明根际浇灌ALA 溶液可以提高苹果叶片叶绿素快速诱导荧光值。0.1 mg/L ALA 的荧光值略高于对照，1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA 处理的荧光均显著高于对照，而两者之间没有明显差异。

图2B 显示，ALA 处理叶片PSII 反应中心供体侧放氧复合体受抑程度(Wk)显著低于对照，其中0.1 mg/L ALA 处理比对照低6%，而1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA处理叶片分别低13%和10%，差异均达到显著水平(P ＜0.05)。J 相相对荧光(Vj)和PSII 反应中心最大关闭速率(Mo)代表着PSII 反应中心关闭状态。从图2B 中可以看出，ALA 处理后，苹果叶片Vj有少量下降，但未达到差异显著水平，而Mo显著下降(P ＜0.05)，说明ALA 处理提高了苹果叶片PSII 反应中心开放程度。PSII 最大光化学效率(φP0=Fv/Fm)经ALA 处理后也显著上升，其中0.1 mg/L ALA 处理提高9%，而其他两个处理提高幅度分别为15%和12% (P ＜0.05)。

如图2C，当t=0 时，ALA 处理的苹果叶片PSII反应中心吸收、捕获和热耗散的能量(即ABS/CS、TRo/CS 和DIo/CS)与对照差异不显著(P ＞0.05)。然而，当t=m 时(荧光值最大)，处理叶片单位面积PSII 反应中心传递的能量ETo/CSm比对照高出25%-33%，捕获能量TRo/CSm比对照高出18% ～26%，吸收能量ABS/CSm比对照高出9% ～10%，只有热耗散DIo/CSm仍然降低9% ～13%，说明ALA 处理苹果叶片在强光下单位面积吸收、捕获和传递光能的能力显著提高，而以非学化学形式耗散的能量份额减少。如果以有活性反应中心为单位来计算能量吸收、热耗散、捕获和传递份额，可以看出，所有处理叶片的ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 均小于对照，说明每一个有活性的PSII 反应中心所吸收、捕获、传递以及热耗散的能量都因ALA 处理而下降。出现这种现象的原因是单位面积有活性反应中心的数量因ALA 处理而增加。3 种ALA 处理叶片RC/CS 比对照高3% ～6%。

图2 根际浇灌不同浓度ALA 溶液对秦阳苹果叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(A)，PSII 反应中心活性(B)，PSII 反应中心能量吸收、捕获、传递、热耗散特性(C)，PSI 反应中心活性以及光合性能指数(D)的影响Fig.2 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on fast induction curves of chlorophyll a fluorescence (A)，activity of PSII reaction center (B)，characteristics of energy absorbance，trap，transfer and heat dissipation of PSII reaction center (C)，and activity of PSI reaction center and photosynthetic capacity index (D)of Qinyang apple leaves

δRo和φRo均为PSI 反应中心活性参数，代表着光合电子从QB到PSI 反应中心末端NADPH 的活性。从图2D 中可以看出，ALA 处理叶片δRo和φRo均显著低于对照，特别是δRo，只有对照的73% ～80%，说明ALA 处理可以减轻苹果叶片PSI 反应中心电子传递压力。另外，ALA 处理叶片光合性能指数(包括以吸收为基础的性能指数PIABS、以叶面积为基础的性能指数PIcs和包括PSI 和PSII 在内的整个性能指数PItotal)均显著高于对照，其中PIABS比对照高出62% ～118%，PIcs比对照高出48% ～73%，PItotal比对照高出43% ～76%(P ＜0.01)。ALA 浓度越高，提高幅度越大。

2.3 根际浇灌ALA 溶液处理对秦阳苹果叶片抗氧化酶活性的影响

表1 显示，ALA 处理的苹果叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均有不同程度上升。其中，0.1 mg/L和1.0 mg/L ALA 处理后秦阳苹果叶片SOD 活性上升了11.4%和15.4%，与对照差异达到显著水平，但是10 mg/L ALA 处理叶片SOD 活性反而低于对照。与此不同的是，POD 活性随着ALA浓度提高呈逐渐上升趋势，其中10.0 mg/L ALA 处理POD 活性是对照的5.8 倍，差异达到显著水平。低浓度ALA 处理显著提高苹果叶片CAT 活性，其中0.1 mg/L和1 .0 mg/L ALA 处理后苹果叶片CAT 活性比对照高出85%和38%(P ＜0.05)，但10.0 mg/L ALA处理叶片CAT 活性反而与对照差异不显著。0.1 mg/LALA 处理的苹果叶片APX 活性与对照差异未达到显著水平，1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA 处理对APX活性的促进效应达到显著水平。

表1 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片抗氧化活性的影响Table 1 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the antioxidant activity of Qinyang apple fruits

2.4 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片活性氧及丙二醛含量的影响

图3A 显示，只有0.1 mg/L ALA 处理对过氧化氢含量的降低达到显著水平(P ＜0.05)。ALA 对超氧阴离子生成速率的影响随着浓度提高而效应增大(图3B)。10.0 mg/L ALA 处理叶片超氧阴离子生成速率只有对照的31%。类似地，膜脂过氧化产物丙二醛含量也是随着ALA 浓度增加而逐渐降低(图3C)，表明根际浇灌较高浓度的ALA 溶液可显著降低苹果叶片细胞膜脂质伤害程度。

图3 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片过氧化氢(A)、超氧阴离子生成速率(B)以及丙二醛(C)含量的影响Fig.3 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the H2O2(A)，superoxide anion production rate (B)and malonaldehyde (MDA)content (C)of Qinyang apple leaves

2.5 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果叶片矿质营养元素含量的影响

表2 显示，根际浇灌ALA 溶液将导致苹果叶片P、K 和Na 含量下降，同时，Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 等元素含量上升。当ALA 浓度达到1.0 mg/L以上时，苹果叶片P 含量显著低于对照。根际浇灌ALA 溶液显著降低了K 和Na 含量，0.1 mg/L ALA 处理后，苹果叶片的K 和Na 含量就显著低于对照;浓度进一步提高，含量下降幅度就更大。ALA 对苹果叶片Ca 含量的促进效应随着浓度提高而增大，1.0 mg/L和10.0 mg/L的处理效应达到差异显著水平(P ＜0.05)。对于其他元素含量而言，0.1 mg/L、1.0 mg/L和10.0 mg/L的ALA 处理都有显著促进效应，其中，0.1 mg/L ALA 对Mg、Fe 和Cu 的促进效应最大，分别比对照高出19%、52%和222%。此外，1.0 mg/L ALA 处理对苹果叶片Zn 含量的促进效应最大，处理叶片比对照高出42%。

表2 不同ALA 浓度处理对秦阳苹果叶片矿质营养元素含量的影响Table 2 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the leaf mineral elements of Qinyang apple

2.6 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果果实品质的影响

表3 显示，根际浇灌ALA 溶液可以显著提高秦阳苹果果皮花青苷含量，其中，0.1 mg/L 处理效应最好，果皮花青苷含量增加123%。0.1 mg/L ALA处理可显著提高苹果可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白质、维生素C 含量和果实糖酸比(P ＜0.05)，对可滴定酸含量的影响不显著。

表3 根际浇灌ALA 溶液对秦阳苹果内外品质的影响Table 3 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the outside and inside quality of Qinyang apple fruits

3 讨论

ALA 提高植物叶片光合性能效应已经有多篇研究报告［4，8，14，16］，其中大多数是叶面喷施的效果研究，而且有研究认为，根施不如叶施［30］。但是，ALA对光不稳定，尤其是在苹果园中，生长季节果实套塑膜袋，采收前也不解开，外源ALA 无法直接喷布到果面上，因而ALA 在套塑膜袋果园中应用遇到障碍。假如能够根系施用，则不仅可以防止ALA 光解，而且可以避开果袋障碍，从而更加有利于ALA在果树生产上应用。本研究结果表明，根际浇灌ALA 溶液同样可以促进苹果叶片叶绿素合成，提高光化学能量转换效率。这与叶面喷施效应相似［14］。试验还观察到，江苏丰县苹果普遍存在着叶片黄化现象，而根际浇灌ALA 溶液可明显缓解叶片黄化程度。从数据上看，根际浇灌ALA 溶液显著提高苹果叶片叶绿素含量，这可能与ALA 作为叶绿素生物合成的关键前体，参与叶绿素合成调节有关［1］，也可能与ALA 提高叶片Fe 含量有关。另一方面，ALA显著提高苹果叶片Chl.b/ Chl.a 比值，说明ALA 对叶绿素b 合成的促进效应更大。这印证了前人有关ALA 促进叶绿素a 向叶绿素b 转化的论断［31］。由于叶绿素b 的主要功能是吸收散射光，ALA 处理导致苹果叶片叶绿素b 含量提高，有利于弱光条件下植物叶片更好地吸收散射光能。

根际浇灌ALA 可以提高苹果PSII 反应中心供体侧、反应中心本身以及受体侧电子传递活性。Wk、Vj和Mo著下降，同时，φPo和Ψo显著上升，充分说明ALA 处理对PSII 反应中心活性的促进效应。从光能吸收、捕获、传递以及热耗散角度看，当暗适应叶片转到光下(t =0 时)，ALA 处理叶片ET0/CS 有少量上升，而在充分照光(t =m)时，处理叶片TRo/CSm和ETo/CSm大幅上升，表明在强光照射下，ALA 处理叶片捕获光能和传递光化学能的能力显著提高。这是前人［14］研究报告中没有观察到的。由于试验测定正值夏季高温强光季节，强光下叶片捕获和传递光能的能力提高不仅可以提高苹果叶片对光能的吸收利用效率，而且暗示着叶片抵抗光抑制的能力增加。如果从单位反应中心吸收、捕获、传递和热耗散角度看，几乎所有指标(包括ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC 和DIo/RC)均因ALA 处理而下降，而有活性的反应中心密度增大。这也与前人报道相似［14］，说明ALA 处理可以缓解强光对苹果叶片的光抑制程度。

本研究首次将δRo和φRo运用于ALA 处理苹果叶片PSI 反应中心活性分析，δRo为一个电子从PSII与PSI 之间的某个电子载体(如QB)传递到PSI 末端电子受体NADP 上的效率，而φRo为PSI 受体末端被还原的量子效率［32］。根际浇灌ALA 导致苹果叶片δRo和φRo下降，这意味着从QB传递来的电子只有一部分用于NADP 还原，因而PSI 反应中心附近存在着其它电子传递途径，可以接受PSII 传递来的电子。然而，苹果叶片光合性能指数(包括PIABS、PIcs和PItotal)并没有因为δRo和φRo下降而下降，相反，ALA处理叶片的性能指数明显高于对照。这与谢荔等［33］在葡萄上观察到的结果相似，他们提出，分布于PSI附近的SOD 可以消除PSI 反应中心产生的超氧阴离子并生产H2O2，产生的H2O2通过POD、CAT 或APX等被清除，从而缓解PSI 反应中心的光抑制，提高整个光合系统活力。根际浇灌ALA 同样提高苹果叶片抗氧化酶活性，降低超氧阴离子生成速率和丙二醛含量，因而，ALA 提高抗氧化酶活性可能是其提高叶片光合电子传递效率的重要原因。众所周知，POD、CAT和APX 活性依赖于亚铁血红素辅基［34］，而ALA 是亚铁血红素生物合成的关键前体，外源ALA 处理可以提高萌发中小白菜幼苗亚铁血红素含量［3］，过量合成ALA 的转基因拟南芥也含有更多的亚铁血红素［35］。因而，本研究观察到的苹果叶片抗氧化酶活性提高，一方面是亚铁血红素含量增加的结果，同时可以消除PSI 反应中心附近的超氧阴离子，缓解光合光抑制，对PSI 和PSII 活性都有促进效应，因而，PIABS、PIcs和PItotal均有显著提高。

Watanabe 等［36］提出，ALA 处理可以减少盐胁迫下棉花幼苗对Na+的吸收，而在非盐胁迫下，ALA处理植株K+含量显著下降。Naeem 等［9］在油菜上证实了这一现象。本研究结果与此类似，根际浇灌ALA 溶液可以减少苹果叶片K+和Na+含量。除此之外，我们还观察到，苹果叶片P 含量因ALA 处理而下降。假如这一现象具有普遍性，那么果园施用ALA 时应该适当追加磷钾肥。本研究首次观察到根际浇灌ALA 溶液能显著提高苹果叶片Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 等元素含量，其原因尚不清楚。最近研究结果表明，ALA 能够显著促进苹果叶片气孔开度［37］。那么，这些营养元素会不会在增大的蒸腾拉力作用下更多地被吸收利用是值得深入研究的。

叶面喷施ALA 溶液对果实品质的影响已经有不少报告。在苹果［6，12，13］、梨［38］、桃［39］、葡萄［33］、草莓［40］上，ALA 处理均能不同程度地改善果实品质，标志着ALA 在优质果品生产上有应用前景。本研究提出的根际浇灌法，不仅可以降低ALA 施用浓度，而且可以运用于塑膜袋果实生产，同样可以提高果实品质，特别是促进果皮花青苷积累，从根本上解决了部分塑膜袋果实不能施用外源ALA 的难题。

综上所述，根际浇灌0.1 ～10.0 mg/L ALA 溶液，可以促进并调节秦阳苹果叶片叶绿素合成，提高抗氧化能力，缓解PSI 光抑制，增强光合系统活性，提高光合性能指数，还能提高叶片Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 含量，但降低P、K 和Na 含量。根灌ALA 溶液可以提高秦阳苹果内外品质。

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