三氧化二砷联合COX-2抑制剂塞来昔布对高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM的体内、体外抗肿瘤实验研究

高克非，曾 根，胡昀昀，卜亚丽

(1.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东 广州 510405；2.海南省中医院妇产科，海南 海口 570203)

三氧化二砷联合COX-2抑制剂塞来昔布
对高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM的体内、体外抗肿瘤实验研究

高克非1，曾 根2，胡昀昀1，卜亚丽1

(1.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东 广州 510405；2.海南省中医院妇产科，海南 海口 570203)

目的 探索三氧化二砷和COX-2抑制剂塞来昔布对高转移性卵巢癌细胞的联合抗肿瘤效应。方法在体外实验中，三氧化二砷和塞来昔布作用于HO-8910PM细胞后，采用噻唑兰(MTT)比色实验、Hoechest33258凋亡染色实验、流式细胞术等方法在细胞水平检验这两种药物单药及联合的增殖抑制和诱导凋亡作用。体内实验中，通过腋窝皮下注射HO-8910PM细胞建立BALB/c-nu裸鼠移植瘤模型，并随机分为阴性对照组、AS2O3单药组、Celecoxib单药组以及AS2O3联合Celecoxib组等四个处理组，AS2O3和Celecoxib分别采用腹腔灌注和灌胃的方法，实验结束时称取各组移植瘤的瘤重，计算抑瘤率并进行组间统计学比较分析。结果三氧化二砷和塞来昔布对HO-8910PM细胞株均具有剂量依赖性的增殖抑制作用，IC50值分别为65.48 μmol/L和49.13 μmol/L。两药联合后的增殖抑制率均大于任一单药抑制率且差异具有统计学意义(P＜0.05)，而联合用药的q值分别为3.23和2.42，均大于1.15，提示两药联合具有显著的协同抗肿瘤效应。Hoechest33258凋亡染色和流式细胞仪检测从凋亡角度进一步证实了MTT的实验结果。裸鼠实验中，联合用药组相对于单药组的抗肿瘤效应未显示出统计学差异，但联合用药组的平均瘤重仍为最小。结论三氧化二砷联合塞来昔布对高转移性卵巢癌细胞HO-8910PM具有明确的协同抗肿瘤作用，该用药方案对高转移性的卵巢癌具有进一步的研究价值。

三氧化二砷；塞来昔布；卵巢癌；裸鼠

三氧化二砷(AS2O3)是一个由血液病走向实体瘤的多靶点抗肿瘤药，除对急性早幼粒细胞白血病的临床治疗已取得世界公认的效果外，它对肝癌、卵巢癌等各种实体瘤均具备良好的抗肿瘤实验效应，其疗效机制包括清除肿瘤干细胞、诱导凋亡、提高细胞内活性氧簇(ROS)的水平、促进分化、抑制NF-κB等，其中诱导凋亡为其主要作用机制[1-3]。塞来昔布(Celecoxib)是一个以环氧化酶-2(COX-2)为靶点的分子靶向药物，对卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、泌尿系及消化道肿瘤等均具有增殖抑制作用，目前认为它的抗肿瘤作用机制包括依赖COX-2和非依赖COX-2的两种途径，最终主要表现为增殖抑制和诱导凋亡效应，并且美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准该药可用结肠癌、乳腺癌等病种的临床治疗[4-7]。

刘定胜等[8]于2011年报道塞来昔布与三氧化二砷联合对慢性粒细胞白血病原代细胞具有协同抑制作用，而本课题组将AS2O3和Celecoxib联合应用于非高转移性的卵巢癌细胞株OVCAR-3也得到了相似的研究结果[9]，但对高转移性的卵巢癌细胞是否具有相同的协同效应目前尚无报道，因此本研究以高转移性的卵巢癌细胞株HO-8910PM为研究对象进一步验证这一假设是否成立。

1 资料与方法

1.1 细胞系及主要试剂 人高转移性卵巢癌细胞株HO-8910PM购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。RPMI-1640培养液和优级胎牛血清(FBS)均为美国Gibco公司产品。Celecoxib标准品购自广州优瓦仪器有限公司(纯度99.5%)，以二甲基亚砜(DMSO)6 ml溶解200 mg备用。亚砷酸注射液(10 ml/10 mg)购自哈尔滨伊达药业有限公司。胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Hoechest33258均为美国Sigma公司产品。酶标仪(BIO-TEK ELX800)为美国宝特公司产品。倒置荧光显微镜及其拍照系统为Olympus公司产品。流式细胞仪(ELITE型)为美国贝克曼库尔特有限公司产品。SPF级、雌性BALB/C-nu裸小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 细胞培养 高转移性卵巢癌细胞株HO-8910PM于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长。

1.3 MTT增殖抑制实验 取处于对数生长期的HO-8910PM细胞，以5.0×103个/孔接种于96孔板，常规培养24 h，更换含不同浓度的Celecoxib和AS2O3的培养液。单药试验中Celecoxib等差设置21.85～109.25 μmol/L 5个药物浓度，AS2O3等比设置9.92～158.73 μmol/L 5个药物浓度。联合用药实验中取9.92 μmol/L的AS2O3和10.93 μmol/L的Celecoxib进行联合、19.84 μmol/L的AS2O3和21.85 μmol/L的Celecoxib进行联合。实验中每孔最终反应体系中DMSO浓度小于3‰。细胞培养44 h后加入MTT溶液(10 mg/ml)10 μl，再放入培养箱反应4 h，吸净孔内液体，再加入DMSO 100 μl/孔，振荡10 min，上酶标仪测定波长为570 nm的吸光值(A570)。实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为实验结果。单药实验中，以药物浓度为横轴，细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞生长曲线。肿瘤细胞增殖抑制率=[1-(物处理组A值-空白对照组A值)/(细胞对照组A值-空白对照组A值)]×100%。按金氏公式[q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea× Eb)]计算所得q值进一步评价两种药物合用是否具有协同或拮抗效应，式中E(a+b)为联合用药的有效率，Ea和Eb分别为两种药物单药的有效率。q值在0.85～1.15范围为两药合用呈单纯相加效应，q值大于1.15为两药合用具有协同效应，q值小于0.85为两药合用具有拮抗效应。

1.4 Hoechest33258凋亡染色实验 取对数生长期的HO-8910PM细胞按2.2×105/孔的密度接种于6孔板并培养24 h后，加入相应药液继续培养。Celecoxib单药实验设21.85 μ mol/L、43.70 μ mol/L、65.55 μmol/L三个浓度，AS2O3单药实验设9.92 μmol/L、19.84 μmol/L、39.68 μmol/L三个浓度，药物联合实验取9.92 μmol/L AS2O3和21.85 μmol/L Celecoxib进行联合，并均设阴性对照组。以药液继续培养细胞48 h后经固定、洗涤，再以10 μg/ml的Hoechest33258溶液避光染色10 min，置于倒置荧光显微镜下拍照。判断凋亡的镜下形态为细胞体积缩小、核固缩、染色质边集、凋亡小体形成等。

1.5 流式细胞仪凋亡检测实验 HO-8910PM细胞培养24 h后以9.92 μmol/L AS2O3、21.85 μmol/L Celecoxib单药及联合培养液处理细胞48 h，并设阴性对照组。细胞收集、洗涤、固定、离心以及RNAase和PI染液处理，行流式检测，观察凋亡比例，实验重复3次。

1.6 荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制实验 取处于对数生长期的HO-8910PM细胞以不含血清的RPMI-1640培养基制成4×107/ml的单细胞悬液，每只裸鼠的右侧腋窝皮下接种200 μl，最终选取合格荷瘤裸鼠共26只分为四组，即阴性对照组(7只)、Celecoxib单药组(7只)、AS2O3单药组(6只)、AS2O3联合Celecoxib组(6只)进行实验。经统计学分析，实验前各组裸鼠的实验前体重和肿瘤大小方差齐(P=0.439和0.401)，且差异无统计学意义(P＞0.05)，表明各组裸鼠实验前条件均衡。给药剂量和方法参照既往相关文献报道并取较低的安全剂量，亚砷酸注射液以生理盐水稀释成0.2 mg/ml，按2 mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射给药。塞来昔布按20 mg·kg-1·d-1剂量灌胃给药。两种药物均为每日一次，连用6 d，休息1 d，共4周。对照组为同等容量的生理盐水灌胃和腹腔注射。用药期间动态观察给药期间裸鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结束时，将所有裸鼠以颈髓离断的方法处死，解剖出瘤块，称瘤重。抑瘤率IR(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，IC50值的计算采用概率单位法。样本间均数的比较采用组间t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验显示的单药增殖抑制及双药协同抗肿瘤作用 AS2O3和Celecoxib对高转移性的HO-8910PM细胞株均具有剂量依赖性的增殖抑制作用，AS2O3的半数抑制浓度(IC50)值是65.48 μmol/L，Celecoxib的IC50值是49.13 μmol/L(图1 A、1B)。联合实验中，9.92 μmol/L AS2O3单药的抑制率为(4.3±0.8)%，10.93 μmol/L Celecoxib单药的抑制率为(7.8±1.2)%，联合用药的抑制率为(38.2±2.0)%，两单药与联合用药比较的t值分别为14.48和12.68，P＜0.05，按金正均公式计算此联合用药的q值为3.23；19.84 μmol/L AS2O3单药的抑制率为(18.2±1.5)%，21.85 μmol/L Celecoxib单药的抑制率为(13.5±1.6)%，联合用药的抑制率为(70.0±1.9)%，两单药与联合用药比较的t值分别为26.24和27.75，P＜0.05，按金氏公式计算的q值为2.42(图1C)。由此可见，两药联合后的增殖抑制率均大于同浓度AS2O3和Celecoxib单药的抑制率，且P＜0.05，q＞1.15，提示两药联合具有显著的协同抗肿瘤效应。

图1 AS2O3和Celecoxib单药及联合对HO-8910PM细胞株的增殖抑制作用

2.2 AS2O3和Celecoxib单药及联合促进凋亡的形态学表现 HO-8910PM细胞经三个药物浓度的AS2O3(图2B～2D)和三个药物浓度的Celecoxib (图2 F～H)单药作用，镜下均显示浓度依赖的细胞凋亡增加，可观察到凋亡小体形成、核固缩、染色质边集等细胞凋亡形态；在联合用药实验中，可见两个单药处理组凋亡细胞较少，而联合用药组凋亡明显增多(图2J～2L)。

2.3 AS2O3和Celecoxib联合促进凋亡的流式细胞术结果 HO-8910PM细胞株经9.92 μmol/LAS2O3作用后凋亡率为(4.2±1.0)%，21.85 μmol/L Celecoxib作用后凋亡率为(12.0±2.5)%，两药联合作用后的凋亡率为(55.2±3.0)%，两个单药组与联合用药组比较的t值分别为38.2和30.9，差异均具有统计学意义(P＜0.05)见图3。

2.4 荷瘤裸鼠实验中的肿瘤生长抑制情况 实验过程中各组裸鼠均无未见致死性毒性反应。各处理组肿瘤的体积和裸鼠体重均随时间的延长而增加，且趋势相同，均为对照组增加的较快，联合用药组增加的最慢，Celecoxib组和AS2O3组介于对照组和联合组之间。实验结束后，剖出瘤块称取瘤重，各组平均瘤重、抑瘤率以及各用药组与对照组比较的组间P值均见表1。由此可见，各检验的P值均大于0.05，差异无统计学意义，但仍可见联合用药组在各组中瘤重最小，统计学检验的P值也最小(图4)。

图3 流式细胞术检测AS2O3和Celecoxib单药及联合作用于HO-8910PM细胞株的凋亡比例

图4 荷瘤裸鼠实验中的BALB/c-nu裸鼠和移植瘤标本

表1 裸鼠实验结束时的各组平均瘤重、抑瘤率比较(±s)

表1 裸鼠实验结束时的各组平均瘤重、抑瘤率比较(±s)

组别对照组Celecoxib组AS2O3组联合用药组平均瘤重(g) 0.899±0.156 0.568±0.158 0.585±0.127 0.437±0.099抑瘤率(%) 0 36.82 34.93 51.39P值0.594 0.781 0.148

3 讨论

卵巢癌是死亡率最高、预后最差的一类妇科恶性肿瘤，化疗在卵巢癌的治疗中与手术相辅相承，具有十分重要的地位，作为临床研究的热点，卵巢癌化疗方面不断有新的探索和尝试。

三氧化二砷(AS2O3)是一个以诱导凋亡作用为主的多靶点药物，对以急性早幼粒细胞白血病(APL)为代表的各种血液系统恶性疾病具有显著的疗效，近年来针对卵巢癌、肝癌等多种实体瘤有效的研究报道也不断涌现[1，3，10-11]。环氧化酶-2(COX-2)是花生四烯酸代谢途径中合成各种前列腺素(PGs)的关键限速酶，包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中都存在COX-2高表达[12]，因此，选择性的COX-2抑制剂例如塞来昔布(Celecoxib)在卵巢癌方面的研究报道也不断出现，特别是该药联合其他化疗药物两方面大多数取得了较为满意的结果[7，13-14]，而也有报道该药物的诱导凋亡效应更多的与非COX-2靶点的抑制有关[4]。

刘定胜等[8]在2011年曾报道塞来昔布与三氧化二砷联合对慢性粒细胞白血病原代细胞具有协同抑制作用，而胃癌、白血病的相关研究表明AS2O3处理后细胞内COX-2的表达明显降低[15-16]，甚至有研究认为COX-2是影响AS2O3作用后的细胞是否可以继续存活的关键蛋白[17]，根据以上研究结果我们认为，三氧化二砷联合与塞来昔布的协同抗肿瘤效应既有直接研究证据的支持，又有COX-2作为潜在联合作用靶点的确认，是一个在实体瘤方面值得广泛深入研究的一个用药方案。

上皮性卵巢癌在病理分化上有中高分化和低分化之分，临床生物学行为上有高转移和非高转移之别，本课题组将两药联合应用于非高转移性的卵巢癌细胞OVCAR-3也得到了具有协同抗肿瘤作用的实验结果，但在高转移性的卵巢癌中是否具有同样的效应目前尚无报道，因此，我们以高转移性的卵巢癌细胞株HO-8910PM为研究对象，将AS2O3与Celecoxib的联合效应在细胞及裸鼠水平分别进行了检验。

本研究中MTT实验结果显示，9.92 μmol/L AS2O3的单药抑制率为(4.3±0.8)%，10.93 μmol/L Celecoxib单药的抑制率为(7.8±1.2)%，联合用药的抑制率为(38.2±2.0)%；19.84 μmol/L的AS2O3单药的抑制率为(18.2±1.5)%，21.85 μmol/L Celecoxib的单药抑制率为(13.5±1.6)%，联合用药的抑制率为(70.0±1.9)%，由此可见联合用药的抑制率均远大于组内单药的抑制率(P＜0.05)。按金正均公式计算两联合用药组的q值分别为3.23和2.42，远大于1.15，提示具有显著的相同抗肿瘤作用。倒置荧光显微镜下观察Hoechest33258凋亡染色情况，结果显示两个单药处理组凋亡细胞较少，联合用药组凋亡明显多于单药组。流式细胞仪进一步检测了凋亡比例情况，两药单独作用的凋亡比例分别为(4.2±1.0)%和(12.0±2.5)%，两药联合作用后的凋亡率为(55.2±3.0)%，经统计学分析差异均具有统计学意义(P＜0.05)。在裸鼠实验中，为避免出现不可控的毒副作用，两药的给药剂量均为各文献报道中的较低剂量，而本课题的裸鼠研究显示了阴性的实验结果，分析可能是与该剂量选择有关，但尽管如此，联合用药组仍为平均瘤重最低组。以上实验结果证明，AS2O3与Celecoxib联合应用，无论对非高转移性的卵巢癌细胞还是高转移性的卵巢癌均具有协同抗肿瘤效应。

在两药的协同抗肿瘤机制上有研究已给我们一定的提示，例如Liu等[16]研究发现，胃癌细胞系SGC-7901经AS2O3作用后COX-2的表达下调，再继续给予塞来昔布作用后，COX-2的表达则进一步下调，并且与AS2O3单药处理时比较差异有统计学意义，这提示COX-2确定为二者协同作用的靶点。此外，AS2O3和Celecoxib均可抑制肿瘤细胞NF-κB的表达[18-19]、下调Survivin的表达[20-21]，提示NF-κB信号通路和Survivin信号通路也是AS2O3和Celecoxib的联合作用靶点。本课题组下一步将对三氧化二砷和塞来昔布的联合作用机制进行深入探讨，并调整用药剂量进一步重复验证裸鼠体内抗肿瘤实验，以期得到一个较为理想的实验结论。

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In vitro and in vivo anti-neoplasm effects of arsenic trioxide combined with COX-2 inhibitor on highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.

GAO Ke-fei1,ZENG Gen2,HU Yun-yun1,BU Ya-li1. 1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Hainan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital,Haikou 570203,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the anti-neoplasm effects of the combination of arsenic trioxide and COX-2 inhibitor(celecoxib)on highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.MethodsIn thein vitrotest, the HO-8910PM cells were treated with AS2O3or celecoxib or both agents.Cell proliferation was assessed by MTT assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry and Hoechest33258 fluorescence staining.In thein vivotest,the nude mice bearing transplanted tumors were divided into control group,AS2O3group,celecoxib group,and AS2O3plus celecoxib group,and were intraperitoneally injected with AS2O3and(or)intragastrically administered with celecoxib. The weight of xenografts was measured after treatment and the inhibition rate was calculated.ResultsDose-dependent anti-proliferative effects were observed in MTT test.The IC50value of AS2O3was 65.48 μmol/L,and that of celecoxib was 49.13 μmol/L.When celecoxib and AS2O3were applied simultaneously,the proliferative inhibition rate was higher than that of the group treated with celecoxib or AS2O3alone(P＜0.05),and theqvalues were 3.23 and 2.42,respectively,both of which were greater than 1.15.The apoptotic results of flow cytometry and Hoechest33258 fluorescence staining proved the prior results from MTT test.In thein vivotest,there were no significant differences between single-agent group and two-agent group,but the average tumor weight of the two-agent group was also the minimum in the four groups.ConclusionThere are synergistic effects when arsenic trioxide and celecoxib are used in combination in highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.The combined regimen of the two agents is worth further research.

Arsenic trioxide;Celecoxib;Ovarian cancer;Nude mice

R-332

A

1003—6350（2015）14—2032—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0736

2015-01-21)

高克非。E-mail:schsunms@.163.com