瘦素在心衰患者心肌中的表达及其与心肌炎症反应的相关性

王梦龙，刘剑芳，刘梦林，冯 颖，袁文慧，万 军

(武汉大学人民医院心血管内科，湖北 武汉 430060)

瘦素在心衰患者心肌中的表达及其与心肌炎症反应的相关性

王梦龙，刘剑芳，刘梦林，冯 颖，袁文慧，万 军

(武汉大学人民医院心血管内科，湖北 武汉 430060)

目的 探讨瘦素(Leptin)在心力衰竭患者心肌中的表达及意义。方法收集行心脏移植的心力衰竭患者左心室心肌样本20例，同时收集配型不成功的供体心肌样本(对照组)9例，分别检测心肌组织中Leptin、B型利钠肽(NPPB)、白介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平，并分析Leptin与NPPB、IL-6及TNF-α含量的相关性。结果与对照组比较，心衰患者心肌组织Leptin mRNA和蛋白水平明显上调(P＜0.01)，NPPB、IL-6及TNF-αmRNA水平升高；相关分析发现心衰患者心肌Leptin mRNA表达水平与心力衰竭严重程度(NPPB)、心肌炎症反应程度(IL-6和TNF-α)均呈正相关(r=0.804，P＜0.01；r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。结论心衰患者心肌组织Leptin表达水平增高，且与心肌炎症反应程度相关；Leptin可能通过调节心肌炎症反应参与心衰后心肌重构过程。

瘦素；心力衰竭；炎症反应；心肌重构

瘦素(Leptin)是最早被发现的脂肪细胞合成和分泌的细胞因子[1]，具有调节能量代谢的作用，血浆Leptin浓度与体重指数和肥胖程度正相关[2]。随后证实其他组织如脑、骨骼肌、胎盘、心脏等组织同样可以合成和分泌Leptin[3-4]，通过自分泌和旁分泌的方式调节脏器功能。现有的研究提示血清Leptin水平与心肌梗死[5]、高血压病[6]、卒中[7]等心血管不良事件发生率相关。心衰患者循环血Leptin浓度升高，与心衰患者循环血炎症反应程度相关[8-9]，基础研究证实缺血再灌注等病理刺激可以诱导心肌Leptin表达[10]，但Leptin在心衰患者心肌组织中的表达及其与心肌炎症反应程度之间关系的报道甚少。因此本研究拟通过收集心衰患者左心室心肌组织，检测心肌Leptin和炎症指标表达水平并分析其相关性，以明确Leptin在心衰患者心肌重构病理生理过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 心肌标本收集 参照之前方法[11]收集2012年9月至2013年12月期间因严重心功能不全行心脏移植患者的左心室心肌组织，所有心衰患者的诊断均符合2012年欧洲心脏病协会发布的心衰诊断及治疗指南[12]。同时收集配型不成功的供体心脏左心室心肌组织作为对照组，排除有严重肝肾功能不全、心脏病史的供体标本。所有标本均取左室前壁心肌组织，以最大程度保证样本的均一性。心肌组织分离后迅速放至液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱保存备用。

1.2 Real-time PCR检测心肌Leptin、B型利钠肽(NPPB)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α) mRNA水平 Trizol法提取心肌组织总RNA，Nanodrop 2000测定RNA浓度，取2 μg RNA反转录成cDNA。利用罗氏Light Cycler 480 Real-time PCR仪进行相应指标的特异性扩增，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法进行定量分析，相应试剂购于Roche公司。目标基因与内参基因的特异性引物序列见表1，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。反应条件为：95°C预变性10 min；95°C变性10 s、60°C退火10 s、72°C延伸20 s，共40个循环。

表1 实时荧光定量PCR特异性引物序列

1.3 Western blot检测心肌Leptin蛋白水平 取适量心肌组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按照40 μg/孔道上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，之后将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBS中室温封闭1 h，封闭后用TBST洗膜5 min，共3次。将PVDF膜置于Leptin一抗(Abcam，1:1 000)中4℃孵育过夜。次日使用相应种属的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后用Bio-RAD凝胶成像系统检测目的条带，以GAPDH为内参分析Leptin表达水平。

1.4 统计学方法 计量数据以均数±标准差(x-±s)表示，采用SPSS18.0软件进行统计学处理，组间比较采用独立样本t检验，Leptin与NPPB、IL-6及TNF-α相关性采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共收集到心衰患者心肌组织20例，均为男性，病因包括扩张型心肌病(DCM，12例)和缺血性心肌病(ICM，8例)，同时共收集到供体心肌组织(对照组)9例。心衰组患者平均年龄大于对照组[(53.55±10.84)vs(38.11±7.70)，t=-4.415，P＜0.01]。心衰组左室舒张末期内径为(67.90±9.69)mm，平均射血分数为(28.80±5.95)%。

2.2 Leptin mNRA及蛋白表达水平 与对照组相比，心衰组患者心肌中Leptin mRNA表达水平明显上调(升高约4.7倍)，差异具有统计学意义(t=-8.653，P＜0.01)。同样，Western blot证实Leptin蛋白在心衰患者心肌中表达水平明显高于对照组(t=-11.607，P＜0.01，图1)。

2.3 Leptin mRNA水平与NPPB、IL-6及TNF-α的相关性 NPPB是编码B型利钠肽的基因，其表达水平可以反映心衰严重程度。NPPB mRNA表达在心衰组心肌中明显上调(图2)，且心衰患者心肌Leptin mRNA水平与NPPB mRNA水平明显正相关(r=0.804，P=0.002)。IL-6、TNF-αmRNA水平一定程度上反映心肌炎症反应程度，在心衰发生后心肌中两者表达水平均增高(图2)，Spearman关联分析发现Leptin mRNA与IL-6、TNF-αmRNA水平均呈正相关关系(r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。

图1 心衰组与对照组心肌Leptin表达水平

注：a心衰组与对照组比较，P＜0.01

图2 心衰组与对照组心肌NPPB、IL-6及TNF-α mRNA表达水平

3 讨论

心力衰竭发生后心肌出现一系列结构与功能的改变，称为心肌重构。心肌重构的发生机制尚不完全清楚，氧化应激、炎症反应、内质网应激、自噬等多种病理生理过程均参与了心肌重构过程。脂肪细胞因子如脂联素、Leptin等具有多功能效应的细胞因子在心血疾病中的作用受到越来越多的关注。

早期的研究发现心衰患者血清Leptin水平升高，与心衰患者胰岛素抵抗程度相关[9]，提示Leptin可能在心衰患者能量代谢过程中起重要作用。随着研究的深入，血清Leptin水平被认为是心衰诊断的一个指标[13]，可以反映心衰患者炎症反应程度[14-15]。有氧运动可以降低冠心病风险，可能与有氧运动降低患者血清Leptin、TNF-α等因子水平有关[16]。基础研究证实Leptin在心肌肥厚和其他心血管疾病模型中起重要作用[17]。Leptin刺激增加乳鼠心肌细胞表面面积，促进胚胎基因的表达，通过p38途径参与心肌细胞肥大过程[18]。另外，Leptin还参与AngⅡ刺激和内皮素刺激引起的心肌肥厚过程[19]。而抑制Leptin表达可以降低IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子水平，改善心肌细胞和心脏收缩功能[15，20]。这些研究均提示心肌Leptin在心肌病理生理过程中具有重要作用。

我们的研究发现：与对照组相比，心衰患者心肌中Leptin mRNA和蛋白表达水平增高，炎症反映相关指标IL-6、TNF-αmRNA表达水平也增高，关联分析发现Leptin水平与心力衰竭严重程度和炎症反应程度正相关，这与其他学者在血清标本中的研究结果一致[14-15]。我们推测心肌细胞合成和分泌的Leptin可能通过调节炎症反应过程参与心衰后心肌重构过程。

本研究尚存在一些不足，首先，纳入研究的标本例数较少，年龄差异较大；其次，我们的研究仅提示心肌Leptin表达水平与心肌炎症反应程度相关，但该结果并不能证实Leptin水平与心肌炎症反应及心肌重构之间的因果关系，尚需进一步动物或细胞实验验证相关结果。总体来讲，心肌Leptin可能通过调节炎症反应参与心衰后心肌重构过程中，但具体机制尚需进一步研究。

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Expression of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.

WANG Meng-long,LIU Jian-fang,LIU Meng-lin,FENG Ying,YUAN Wen-hui,WAN Jun.Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.MethodsLeft ventricular tissues were collected from 20 transplanted hearts with heart failure(n=20,the study group)and 9 donor hearts which were not matched with patients(n=9,the control group).Expression levels of Leptin,natriuretic peptide precursor B(NPPB),interleukin-6 (IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-α)in the myocardium were detected.Spearman analysis was applied to test the correlations between mRNA levels of Leptin and NPPB,IL-6,TNF-α.ResultsCompared with control group,the mRNA and protein levels of Leptin in the study group was significantly increased(P＜0.01).Also,the mRNA levels of NPPB,IL-6,TNF-αwere significantly higher than those in the control group.The mRNAlevels of Leptin was positively correlated with NPPB,IL-6 and TNF-αmRNA levels in the myocardium of patients with heart failure(r=0.804,P＜0.01;r=0.457,P＜0.05;r=0.336,P＜0.05).ConclusionThe expression of Leptin is increased at both mRNA and protein levels in the myocardium of patients with heart failure,and Leptin levels are positively correlated with the severity of inflammation.Leptin may play an important role during cardiac remodeling through regulating inflammation process.

Leptin;Heart failure;Inflammation;Cardiac remodeling

R541.6

A

1003—6350（2015）14—2040—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0738

2015-04-15)

国家自然科学基金(编号：81170208)；湖北省科技厅项目(编号：302-131725)

万 军。E-mail：wanjun1963@126.com