貉源犬瘟热病毒昌黎株的分离鉴定及其H基因序列分析

王建科，芮 萍，程悦宁，马增军*，刘曜综

(1 中国农业科学院特产研究所，吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春，130112；2 河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室)



貉源犬瘟热病毒昌黎株的分离鉴定及其H基因序列分析

王建科1，芮 萍2，程悦宁1，马增军*2，刘曜综2

(1 中国农业科学院特产研究所，吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春，130112；2 河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室)

为了解河北省毛皮动物犬瘟热病毒的流行及遗传变异情况，采用 Vero 细胞从具有犬瘟热临床症状的貉肺脏样品中分离出一株病毒，经过间接免疫荧光、RT-PCR和动物回归试验等鉴定，分离的病毒为犬瘟热病毒(CDV)，命名为 CDV CL14株。对该病毒血凝蛋白H基因进行克隆测序和遗传进化分析表明，CDV CL14分离株属于Asia-1型，为我国的流行毒株，H基因核苷酸及其编码氨基酸序列与我国流行毒株有较高的同源性，其中核苷酸同源性最高的为 HeB(09)1株和 LN-13-1株，同源性同为 99.1%，而氨基酸同源性最高的为 LN-13-1株，同源性为 99.3%。

犬瘟热病毒；H基因；分离；鉴定

犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的多种动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，是水貂、狐狸和貉子等毛皮动物的主要传染病之一，给毛皮动物养殖业造成了巨大的经济损失[1，2]。该病临床上以双相热、卡他性鼻炎及随后引起的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎、神经等症状为主要特征。CDV自然感染宿主有食肉目所有8个科，以及偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害性也越来越大，大熊猫也有感染发病的报道[3]，甚至从患有 Paget’s 疾病的病人体内检测到了CDV的核酸存在[4]。

2014年8月，河北省昌黎县某貉子养殖场的当年生幼貉，突然出现了咳嗽、呕吐、腹泻等症状，个别貉子还出现了神经症状；病貉眼睑周围有脓性分泌物，鼻镜干燥；动物剖检发现，脾脏肿大，膀胱黏膜有出血点，肺脏表面出血。本研究从病貉脏器内分离出一株病毒，经过鉴定为CDV，并且对其H基因进行了克隆测序及遗传进化分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料

Vero细胞、阳性对照株CDV3疫苗株由中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室保存；健康貉子引自中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地；CDV抗原检测试纸条引自韩国BioNote, Lnc.；CDV N蛋白单克隆抗体引自VMRD公司，FITC标记羊抗鼠二抗引自北京中杉金桥生物技术公司；Trizol Reagent引自Life Technologies公司；反转录酶M-MLV，RNasin，Taq聚合酶，dNTPs，DNA Marker，pMD18-T引自 TaKaRa公司。

1.2 样品处理

采集河北省昌黎县某貉场疑似犬瘟热的貉子病料5例，经CDV抗原试纸条检测为阳性，无菌取死亡貉子肺脏样品加MEM培养基制成1∶10的乳剂，8 000 r/min离心10 min，取上清，经0.45 μm微孔滤膜过滤，置于-80 ℃ 冰箱冻存备用。

1.3 病毒分离

将上述处理好的病料样品接种于长成单层的Vero细胞，于37 ℃ CO2的体积分数为0.05条件下培养，并逐日观察细胞病变(CPE)；如无CPE连续盲传培养，至第4代仍无CPE可认定为阴性。同时设正常细胞对照。阳性培养物冻融3次后于 -80 ℃ 冷冻保存备用。

1.4 病毒电镜鉴定

取已出现CPE的第4代病毒Vero细胞培养物，冻融3次后收毒，5 000 r/min离心10 min，取上清液用质量浓度为20 g/L的磷钨酸负染进行电镜观察。

1.5 RT-PCR鉴定

参照王凤雪等[5]的方法，引物对H1：5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′和H2：5′-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用Trizol试剂提取病毒RNA，经反转录后PCR扩增，对分离病毒进行分子生物学试验鉴定。

1.6 病毒理化性质鉴定

对分离病毒进行理化学特征鉴定。参考程悦宁[6]的方法对分离株病毒进行核酸型、氯仿、乙醚、pH 3.0耐酸及60 ℃耐热试验鉴定。同时设立不作处理的正常对照组。

1.7 间接免疫荧光鉴定

向长成单层的Vero细胞接CDV CL14株第4代病毒，48 h后用预冷的质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液室温固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；加入用PBS 100倍稀释的CDV单抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗涤3次，每次5 min；加入1 000倍稀释的二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗涤3次，每次5 min；荧光显微镜下检查有无特异性的荧光。同时设置CDV3疫苗株对照。

1.8 动物回归试验

选择CDV中和抗体于 l∶2的3月龄健康貉子10只，随机分为2组，每组5只。人工感染组5只经皮下注射，攻毒剂量为2 mL(2×104.5TCID50)；对照组5只，相同方式注射2 mL Vero细胞培养物，分别隔离观察饲养15 d，每天观察临床症状；并于攻毒第3天开始收集攻毒貉子肛拭子；试验第15天扑杀全部貉子进行大体解剖观察。

1.9H基因序列分析

参照ZHAO JJ et al[7]建立的方法，略作改进进行CDVH基因的扩增和测序，引物对H3：5′-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3′和H4：5′-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，RNA提取及RT-PCR参考文献记载的方法进行，对测序结果应用Lasergene生物软件的SeqMan进行拼接，对H基因和GenBank中登录的CDV参考毒株进行同源性比较，并用MEGA6.0构建系统发育树。

2 结 果

2.1 病毒分离

应用 Vero 细胞对貉肺脏样品进行病毒分离。在接毒细胞的前2代未见明显病变，盲传至第3代时，细胞出现拉网、脱落以及细胞融合成巨细胞等出现典型的CDV细胞病变(图 1)。结果从送检的样品中分离获得1株CDV病毒，命名为CDV CL14株。

2.2 病毒电镜鉴定

取分离毒CDV CL14株第4代细胞培养物，经过处理后在透射电镜下可见圆形病毒粒子，有囊膜、可以看到纤突，该病毒粒子直径大约300 nm(图2)，具有典型的犬瘟热病毒粒子的形态特征。

2.3 RT-PCR

取发病貉子的肺脏提取总RNA，应用引物H1和H2能成功扩增出335 bp的目的片段，与预期大小一致的。PCR结果验证了此貉子感染了CDV。图3为病貉肺脏RT-PCR扩增结果。

图3 CDV CL14株RT-PCR扩增结果M：DNA maker，1：CDV3阳性对照，2：CDV CL株，3：阴性对照

2.4 病毒的理化性质鉴定

CDV CL14株经FUDR处理后其TCID50与对照组差值小于1个对数(log 10)，表明分离病毒的核酸为RNA。CDV CL14经氯仿、乙醚、pH 3.0的酸及60 ℃热处理后，其TCID50与对照组差值均大于2个对数，说明该病毒有囊膜，对氯仿、乙醚及酸敏感而不耐热(具体数据未列出)，以上结果符合CDV的特性。

2.5 间接免疫荧光鉴定

经间接免疫荧光染色后荧光显微镜下观察结果显示，接种病毒液的 Vero 细胞浆中出现特异性亮绿荧光，而正常对照细胞胞浆中无特异性荧光，同时可以看到 CDV3 阳性对照的 Vero 细胞中也能看到特异性的荧光(图4)。

图4 CDV CL14 株间接免疫荧光检测结果A：CDV3阳性对照，B：CDV CL14株，C：正常细胞对照

2.6 动物回归试验

试验组貉子在第5天试验组动物开始出现体温升高现象，随后伴随着厌食、呕吐现象，眼部结膜炎和胃肠道炎症等临床症状出现。RT-PCR检测结果显示，试验组貉子从第5天开始可以肛拭子检测到病毒核酸。攻毒后第15天，对动物进行安乐死后进行大体检剖观察，试验组动物膀胱内壁大量出血斑，肺脏出血淤血，出现萎缩性坏死，胸腔积液，肝脏坏死。对照貉子表现正常，无上述临床表现和病理变化。

2.7H基因序列分析

取CDV CL14株第5代细胞毒提取总RNA，应用引物H3和H4能成功扩增出1 879 bp 的目的片段，与预期大小一致(图5)。PCR产物经胶回收、纯化后，克隆到pMD18-T载体中。选取鉴定阳性重组子送公司测序。H基因序列测定结果表明，该基因全长均为1 824个核苷酸，编码607个氨基酸。将该病毒H基因序列与GenBank中核苷酸序列经过BLAST检索发现同源性最高的均为CDVH基因序列，应用Lasergene生物软件中的MegAlign对CDV CL14及参考株的H基因序列及其编码的氨基酸序列进行同源性分析发现，该病毒与国内流行的参考毒株的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性，其中核苷酸同源性最高的为HeB(09)1株和LN-13-1株，同源性同为99.1%，而氨基酸同源性最高的为LN-13-1株，同源性为99.3%；而与美国疫苗株Onderstpoort的同源性最低，核苷酸和氨基酸的同源性分别为90.5%和90.4%。利用MEGA6.0软件以Neighbor-joining法，对分离株以及GenBank中不同基因型的参考毒株的H基因编码的氨基酸序列建立系统发育树(图6)，表明分离毒株CDV CL14株属于Asia-1型。

图5 CDV CL14株H基因扩增结果M：DNA maker，1：CDV3阳性对照，2：阴性对照，3：CDV CL株

图6 犬瘟热病毒H蛋白系统发生树

3 讨 论

本次研究从犬瘟热病貉肺脏中分离出1株病毒，经细胞培养、理化特性鉴定、间接免疫荧光试验、动物回归试验鉴定和RT-PCR等分子生物学鉴定，分离的病毒为犬瘟热病毒，并对分离病毒H基因进行了遗传进化分析，表明河北省昌黎县毛皮动物群体中流行的CDV属于Asia-1型。

H基因常被用于CDV的基因分型，已报道的有8个基因型，分别为Asia-1型，Asia-2型，Asia-3型，Europe型，European wildlife型，Arctic-like型，America-1型和America-2型，而我国流行毒株最多的为Asia-1型[7～9]。遗传进化分析表明，本次研究分离毒株属于Asia-1型，为我国的流行毒株。对H蛋白的糖基化位点进行分析发现，该分离株的H蛋白有9个N-糖基化位点，分别位于19-21，149-151，309-311，391-393，422-424，456-458，584-586，587-589 和 603-605 位，这与之前报道的我国流行毒株保持一致[8]。

试验表明，分离的病毒为强毒株，动物回归试验可使貉子感染并出现犬瘟热典型症状。本次试验扩增的H基因全长1 824 bp，编码607个氨基酸，与之前报道的大小一致[10]，对CDV CL14分离株的H基因核苷酸和蛋白氨基酸序列分析结果表明，该分离株与国内的流行毒株有较高的同源性，其中核苷酸同源性最高的为HeB(09)1株和LN-13-1株，同源性同为99.1%，而氨基酸同源性最高的为LN-13-1株，同源性为99.3%，从而判断该株病毒为我国目前流行的毒株之一。

[1] 程悦宁,易立,司方方,等.我国毛皮动物主要传染病防控现状及防控建议[J].经济动物学报,2013,17(1):49-54.

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Isolation and Identification of Raccoon Dog Canine Distemper Virus Changli Isolate and Sequence Analysis ofHgene

WANG Jian-ke1,RUI Ping2，CHENG Yue-ning1,MA Zeng-jun2,LIU Yao-zong2
(1 Jilin Provincial Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals,Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun Jilin,130112;China 2 Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science & Techology;China)

To better understand the prevalence and genetic variation of canine distemper virus (CDV) in Hebei province, we isolated a virus from raccoon dog with Vero. This virus strain, named as CDV CL14, was identified as CDV from results of morphology indirect immunofluorescence, RT-PCR and artificial infection of raccoon dogs. Cloning and phylogenetic analysis of theHgene, the results indicated CDV CL corresponds to the Asia-1 genotype and it is the prevalent strain in China. TheHgene shared higher homology with prevalent strain in China. The highest degree of nucleotide homology with HeB(09)1 strain and LN-13-1 strains was 99.1%, and the highest degree of deduced amino acids homology with LN-13-1 strain was 99.3%.

canine distemper virus;Hgene;isolation;identification

河北省科技支撑计划项目(项目编号：13226609D)；河北省畜牧局计划项目(项目编号：2011-1-19)；吉林省省级经济结构战略调整引导资金专项(项目编号：2014Y139)；吉林省特种经济动物生物制品科技创新中心资助研究项目。

2015-06-12; 修改稿收到日期: 2015-06-24

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.003

S852.65+5

A

1672-7983(2015)03-0012-05

王建科(1982-)，男，博士研究生，助理研究员。主要研究方向：毛皮动物疾病防控。

(责任编辑：朱宝昌)

*通讯作者，男，教授，博士。主要研究方向：兽医病原微生物学。E-mail:mzj6699@126.com。