老岭自然保护区天女木兰茎叶中次生代谢产物的含量分析

魏贤星，常 旭，陈 健，徐艳梅， 龙 茹，郭学民，徐兴友*

(1 河北科技师范学院野生植物资源应用研究所，河北 秦皇岛， 066600；2 河北省青龙满族自治县农牧局)



老岭自然保护区天女木兰茎叶中次生代谢产物的含量分析

魏贤星1，常 旭1，陈 健2，徐艳梅2， 龙 茹1，郭学民1，徐兴友1*

(1 河北科技师范学院野生植物资源应用研究所，河北 秦皇岛， 066600；2 河北省青龙满族自治县农牧局)

对河北省老岭自然保护区不同海拔天女木兰茎叶中的次生代谢产物的含量进行了测定与分析。结果显示：① 在不同海拔的同一营养器官中，叶和嫩枝中绿原酸、皂苷和鞣质的质量分数均以1 100 m处的最高，黄酮的质量分数以海拔800 m处叶、1 300 m处嫩枝的最高；② 在同一海拔高度的不同营养器官中，绿原酸和黄酮的质量分数是叶中的高于嫩枝中的，而鞣质的质量分数以嫩枝中的高于叶中的，皂苷的质量分数则在茎叶中无明显差异；③ 在不同海拔高度的营养器官中，总绿原酸的质量分数都要高于其他3种次生代谢产物，而总皂苷的质量分数远低于其他3种次生代谢产物。4种次生代谢产物在海拔1 100 m处的质量分数均最高，总绿原酸、总黄酮和总鞣质的质量分数在海拔500 m处的最低，总皂苷的质量分数在海拔1 000 m处的最低。

天女木兰；茎叶；黄酮；鞣质；绿原酸；含量分析

天女木兰(MagnoliasieboldiiK.Koch)又称小花木兰，系木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)的落叶小乔木，广泛分布于我国吉林、辽宁、河北、湖北、江西、福建、广西、浙江、贵州等省[1]，被《中国物种红色名录》列为易危物种，是观叶、观花、观果、芳香兼备的观赏树种，花、果、叶可提取高级香料，叶可提取精油用于制造化妆品，为很有开发利用前途的珍贵野生植物资源[2～4]。但目前有关天女木兰在代谢水平上的研究还未见报道。绿原酸、皂苷、黄酮和鞣质作为自然界广泛分布的一类天然产物具有多种功能，绿原酸具有清除自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等药用功效，又可用于食品工业抗氧化保鲜[5]，具有较高的经济价值；皂苷具有抗菌、解热、镇静、抗癌等药用作用，又是很强的溶血剂，还能提高机体的免疫能力[6]；黄酮具有扩血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、抗白血病、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗辐射等作用[7～12]；鞣质内服可用于治疗胃肠道出血，溃疡和水泻等症，外用于创伤、灼伤，可减少分泌和防止感染，能使创面的微血管收缩，有局部止血作用,此外,鞣质还有抑菌、抗病毒、解毒、清除超氧自由基、抗变态反应、抗炎、降血压等作用[13,14]。笔者对河北省老岭自然保护区不同海拔天女木兰茎叶绿原酸、皂苷、黄酮和鞣质的含量进行了测定分析，旨在为合理开发和利用天女木兰资源提供基础资料。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

老岭自然保护区位于河北省秦皇岛市青龙县境内，地理坐标为东经119°20′～119°30′，北纬40°05′～40°11′。规划区东西长25 km，南北宽18 km，经营面积6 400 km2。老岭是燕山东段一座独立山体，1 000 m以上的山峰有20多座，主峰天女峰海拔1 424 m。该保护区属暖温带大陆性季风气候，水分条件好，年降水量为715.6 mm，集中在6～8月份，年平均温度8.9 ℃，夏季最高温度29.3 ℃，冬季最低温度为-15.5 ℃，早霜期10月上旬，晚霜期4月下旬，年日照时数2 853 h，植物生长期130～190 d。土壤主要为棕色森林土，阳坡土层薄，为多砾石粗骨土，阴坡土层厚，为壤土或沙壤土，腐殖质多。

1.2 试验材料

2013年6月，在老岭自然保护区不同海拔高度上选择5个天女木兰自然林样地，采用手持GPS仪测定海拔高度，用经纬仪测定林地坡度，各样地的基本情况见表1。在各个样地选择3株成熟天女木兰个体，从每株的东、南、西、北等4个不同方向的树冠中部各采集5条新生枝和5片成熟叶，用湿布包裹，后装入塑封带立即带回实验室，把同一株4个方向同一海拔相同器官的材料混合后洗净，用烘箱在105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干24 h，粉碎后经过金属网筛(筛孔尺寸0.25 mm)，将烘干样品放入磨口广口瓶中，置于干燥器中保存用于测定[15]，每个海拔及每个样品各为3个重复。绿原酸，人参皂苷Rb，芦丁，没食子酸等购自中国药品生物制品检定所。实验于2013年7月进行。

表1 天女木兰生长地的基本情况

1.3 次生代谢产物含量的测定

1.3.1 绿原酸的提取与测定 称取天女木兰粗粉样品0.1 g，放入到试管中，加入10倍量的水煎煮，期间不断搅拌，2 h后过滤，滤渣再用8倍的水重复煎煮2 h，再次过滤，合并提取液，加热浓缩至m(剩余水)∶m(天女木兰粗粉)=1∶1时，加乙醇至其体积分数达0.75，使难溶乙醇的成分从溶液中沉淀析出，使绿原酸分离出来。静置30 min后过滤，减压浓缩抽干。将提取物在324 nm波长处测定吸收度，以中国生物制品检定所提供的绿原酸标准品为对照品，并计算含量[16]。

1.3.2 总皂苷的提取与测定 称取天女木兰粗粉样品0.1 g，加入体积分数为0.70的乙醇8 mL，置于具塞试管，80 ℃水浴提取3 h，待温度降至室温后，3 000 r/min下离心15 min，取上清液，沸水浴蒸干后加4 mL水使其溶解，再加入4 mL乙醚进行萃取，取水层，再蒸干后，用10 mL甲醇溶解，取0.5 mL于试管，加热促使甲醇挥发，再加入0.2 mL的质量浓度为50 g/L香草醛溶液、0.8 mL高氯酸， 70 ℃反应20 min，冷却后，加入5 mL冰醋酸，混匀，722型可见光分光光度计560 nm测定吸光度，试剂空白对照[17]。

1.3.3 黄酮的提取与测定 称取天女木兰粗粉样品0.1 g，加入5 mL甲醇，90 ℃水浴回流2 h，3 000 r/min离心15 min取上清液，定容至25 mL，摇匀，吸取1 mL置洁净试管中，然后加入4 mL 0.1 mol·L-1AlCl3-甲醇溶液，摇匀，以试剂空白作对照，在420 nm处测定吸光度。以芦丁为标准品，其回归方程为y=8.036 2x-0.001 6,R2=0.997 5[18]。

1.3.4 鞣质的提取与测定 称取天女木兰粗粉样品0.1 g，置50 mL棕色量瓶中，加水25 mL放置过夜，超声处理10 min, 冷却后摇匀，静置30 min，使固体物沉淀，过滤至干燥容量瓶中，加水定容至25 mL，作为供试品溶液备用。吸取1 mL提取液至洁净的小烧杯中，然后加入24 mL蒸馏水，再加入2滴质量浓度为50 g/L的靛蓝溶液，用0.1 mol·L-1KMnO4溶液滴定，溶液从蓝色变为绿色再变为黄色为终点。以没食子酸为标准品，其回归方程为y=0.013 6x+0.000 3,R2=0.999 9[19]。

1.4 数据处理

试验处理以及数据测定均3次重复，将所得数据输入DPS数据分析系统进行统计分析，比较不同海拔之间以及茎叶之间次生代谢物的含量并进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同海拔天女木兰茎叶中绿原酸的质量分数分析

不同海拔高度天女木兰茎、叶中绿原酸的质量分数具有相同的变化趋势(表2)，其质量分数由大到小的排列顺序为：1 100 m处、1 300 m处、800 m处、1 000 m处、500 m处。用t检验，成对双样本均值分析进行单尾检验得出，t=16.10，当df=4时，t0.05=2.13

2.2 不同海拔天女木兰茎叶中皂苷的质量分数分析

表3显示了不同海拔天女木兰茎叶总皂苷含量的测定结果。可以看出，不同海拔高度天女木兰的叶与茎中皂苷含量具有相似的变化趋势，以海拔1 100 m处的最多，海拔500 m处与1 000 m处的最少，海拔800 m的与1 300 m处的居中，这与绿原酸的质量分数变化趋势基本相同。

用t检验，成对双样本均值分析进行双尾检验对叶与茎中皂苷的质量分数进行分析：求出t=0.408，当df=4时，t0.05=2.776>t，因此同一海拔高度天女木兰的叶与茎中皂苷的质量分数没有差别。经方差分析和差异显著性检验，结果表明，除800 m处与1 100 m处之间的茎叶皂苷质量分数差异不显著外，其余相互之间差异极显著。

表2 不同海拔高度天女木兰茎叶中绿原酸质量分数比较

注：表中小写英文字母表示在5%水平上差异显著； 大写英文字母表示在1%水平上差异显著，以下同。

表3 不同海拔高度天女木兰茎叶中皂苷质量分数比较

表4 不同海拔高度天女木兰营养器官中黄酮质量分数比较(LSR法)

2.3 不同海拔天女木兰茎叶中黄酮的质量分数分析

在不同海拔高度的天女木兰同一营养器官中，黄酮的质量分数存在一定差异(表4)。叶片中，黄酮的质量分数由大到小的顺序为：海拔800 m处、1 100 m处、1 000 m处、1 300 m处、500 m处；嫩枝中，黄酮的质量分数由大到小的顺序为：海拔1 300 m处、1 100 m处、500 m处、800 m处、1 000 m处的。方差分析和差异显著性检验结果表明，在叶中，除海拔800 m处与1 100 m处天女木兰叶黄酮的质量分数差异不显著外，其他海拔高度之间差异显著或极显著；在嫩枝中，各海拔高度之间黄酮的质量分数差异均显著或极显著。在同一海拔高度的天女木兰不同营养器官中黄酮的质量分数不同，但有共同的规律，即叶中的高于嫩枝中的。

2.4 不同海拔天女木兰茎叶中鞣质的质量分数分析

不同海拔高度的天女木兰同一营养器官中鞣质的质量分数存在一定差异(表5)。叶片中，鞣质的质量分数由大到小的顺序为：海拔1 100 m处、1 300 m处、1 000 m处、800 m处、500 m处；嫩枝中，鞣质的质量分数由大到小的顺序为：海拔1 100 m处、800 m处、1 000 m处、1 300 m处、500 m处。方差分析和差异显著性检验结果表明，在叶中，除海拔800 m处、1 000 m处与1 300 m处天女木兰叶中的鞣质质量分数相互之间差异不显著外，其它各海拔高度之间差异显著或极显著；在嫩枝中，只有海拔1 100 m处的天女木兰嫩枝中的鞣质质量分数与其他海拔高度处的差异极显著，而其他各海拔高度之间差异不显著。鞣质的质量分数在同一海拔高度的天女木兰不同营养器官中的质量分数有着相似的变化规律，即嫩枝中的均高于叶中的。

表5 天女木兰中鞣质质量分数比较(LSR法)

2.5 不同海拔高度天女木兰茎叶中几种次生代谢产物的的质量分数分析

各海拔下天女木兰茎叶中总绿原酸的质量分数都要高于总皂苷、总黄酮和总鞣质的质量分数(图1)，而皂苷的质量分数远低于其他3种次生代谢产物。随着海拔高度的升高，总绿原酸、总皂苷、总黄酮的质量分数表现出升高—下降—升高—下降的变化趋势，而总鞣质的质量分数在海拔800 m处和1 000 m处接近。这4种次生代谢产物在海拔1 100 m处的质量分数最高，总绿原酸、总黄酮和总鞣质的质量分数在海拔500 m处最低,总皂苷的质量分数在海拔1 000 m处的最低。

图1 不同海拔高度的天女木兰茎叶中几种次生代谢产物的质量分数比较

3 讨 论

次生代谢是植物的重要特征，被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，它在处理植物与生态环境的关系中充当着重要的角色[20]。许多植物在受到病原微生物的侵染后，产生并大量积累次生代谢产物，以增强自身的免疫力和抵抗力。在不同海拔高度的天女木兰茎叶中，总绿原酸的质量分数都要高于其他3种次生代谢产物，而皂苷的质量分数远低于其他3种次生代谢产物，但绿原酸和皂苷的质量分数有相似的变化规律，即均在海拔1 100 m地段的最高，海拔1 000 m处、500 m处的较低，而海拔800 m处、1 300 m处的居中。说明海拔高度对绿原酸和皂苷的合成有影响，是多种环境因素作用的结果；同一海拔高度的茎叶中绿原酸的质量分数相比较，叶中的都高于茎中的，可能叶是主要合成和积累绿原酸的部位；同一海拔高度的茎叶中皂苷的质量分数没有差别，预示着天女木兰茎叶中可能不存在皂苷的单独合成途径，叶与茎之间也可能没有相互运输皂苷通道。

在不同海拔高度的天女木兰营养器官中，黄酮和鞣质的质量分数及总的质量分数均存在着一定的差异，表明黄酮和鞣质在天女木兰茎叶中的合成、运输、积累和消耗均具有相对的独立性[21,22]。同一营养器官在不同海拔高度，黄酮和鞣质的质量分数也不同，预示着环境因素在次生代谢过程中起着非常重要的作用。不同营养器官在同一海拔高度黄酮和鞣质的质量分数差异很大，叶中的黄酮的质量分数远高于嫩枝中的，由此推断，天女木兰中的黄酮可能主要由叶合成，可通过嫩枝运输到其它器官，但主要仍贮存在叶中。鞣质的质量分数则以嫩枝中较高，而叶中较低，表明嫩枝和叶都可能是合成鞣质的场所，并且合成后的鞣质在嫩枝、叶中均能积累。总体来说，叶中黄酮和鞣质的总的质量分数较高，这是因为叶光合作用的后期转化产物是黄酮和鞣质的底物，叶光合作用最旺盛，产生底物多，所以合成的黄酮和鞣质也多，因而叶可能是黄酮和鞣质的主要产生器官[23]。

有文献报道[24～28]，一直被用作提取医用黄酮原材料的银杏，其叶片中黄酮的质量分数较高，为27.4 g·kg-1，而在一般植物中的质量分数为20 g·kg-1；在七子花中鞣质的质量分数较高，为9.33 g·kg-1，而在一般植物中的质量分数为7 g·kg-1。在天女木兰的营养器官中，海拔800 m处的叶中黄酮的质量分数最高，为15.95 g·kg-1，海拔1 100 m处的嫩枝中鞣质的质量分数最高，为12.31 g·kg-1。比较而言，天女木兰的黄酮质量分数较低，而鞣质的质量分数很高，具有一定的开发前景。而皂苷在一些中药如人参、三七、黄芪、柴胡等含量较高。据文献报道，绿原酸在金银花中的质量分数是10～59 g·kg-1，在杜仲(皮、叶)中的质量分数是 20～50 g·kg-1[15]。河北地区黄芪中总皂苷的质量分数平均为1.53 g·kg-1[29]，柴胡中总皂苷的质量分数为2.40 g·kg-1[30]。老岭自然保护区海拔1 100 m地段的天女木兰叶中绿原酸的质量分数最高，为19.42 g·kg-1，达到了《中国药典》及补充检验方法限度规定药物中绿原酸的质量分数不低于15.0 g·kg-1的标准[31]，而在茎中的质量分数较低，没有达到《中国药典》规定的标准；天女木兰茎叶中总皂苷的质量分数最高达1.79 g·kg-1，与黄芪中总皂苷的质量分数相当，且在茎与叶中的质量分数没有差异。因此，天女木兰具有较高的药用价值。针对天女木兰叶油已被开发利用的现状，叶中含有的绿原酸、皂苷等活性物质可作为副产物加以利用。

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Stem and Leaf Secondary Metabolites Content Analysis ofMagnoliasieboldiiin Laoling Natural Preservation Area

WEI Xian-xing1,CHANG Xu1,CHEN Jian2, XU Yan-mei2,LONG Ru1,GUO Xue-ming1,XU Xing-you1
(1 Institute of Wild Plant Resources Application, Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei, 066600;2 Hebei Qinglong Manchu Autonomous County Agriculture and Pasture Bureau;China )

Stem and leaf secondary metabolites content ofMagnoliaSieboldiiin different altitude gradients in Laoling Natural Preservation Area , Hebei Province were determined and analyzed. The results show that in different elevations of the same vegetative organs, leaves and shoots of chlorogenic acid, saponins and tannin content are the highest at an altitude of 1 100 m，while the content of flavonoid is the highest in the leaf at an altitude of 800 m and in the shoot at an altitude of 1 300 m. In the same altitude of different organs，chlorogenic acid and flavonoid content in the leaf are higher than that in the shoot, while that of Tannin is on the contrary. Saponins content has no obvious difference in the leaf and shoot. In different elevations, the total chlorogenic acid contents in the vegetative organs are higher than other three kinds of secondary metabolites, and total saponins are far below the other three kinds of secondary metabolites. These four secondary metabolite contents are the highest at an altitude of 1 100 m, the lowest content total chlorogenic acid, total flavonoid and total tannins are at an altitude of 500 m, the total saponins are the lowest at an altitude of 1 000 m .

MagnoliaSieboldii; flavonoids; tannins; chlorogenic acid; saponins; content analysis

河北省自然科学基金项目(项目编号:C2010001538)。

2015-08-15

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.005

S685.99

A

1672-7983(2015)03-0021-06

魏贤星(1988-)，男，硕士研究生。主要研究方向：野生植物资源的保护与利用。

(责任编辑：朱宝昌)

*通讯作者，男，教授，博士，硕士研究生导师。主要研究方向：野生植物资源的保护与利用。E-mail:xuxingyouzlj@126.com。