三氧化二砷对食管癌细胞株EC-1的生长抑制作用*

谷见法 王晓敏 路平

中药砒霜的有效成份即为三氧化二砷（As2O3），可使急性早幼粒细胞白血病临床缓解率达到80%以上[1-2]。许多研究证实，As2O3对多种实体瘤如肝癌[3]、乳腺癌细胞[4-5]、胃癌[6]、骨髓瘤[7]、淋巴瘤[8]、肾母细胞瘤[9]等都有明显的增殖抑制作用。但在食管癌[10]方面，相关研究报道较少见。而食管癌是我国常见肿瘤[11]。本研究探讨食管癌EC-1细胞在三氧化二砷作用的变化，并寻找其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人食管癌细胞株EC-1细胞。

1.1.2 主要仪器 MULTISKAN MK3酶标仪（美国 Thermo electron公司）恒温细胞培养箱（英国RSBionch公司）；Epic XL II型里流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），倒置显微镜（EE 2000-U）（日本Nikon公司），OLYMPUS直立光照照相系统（日本Olympus公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 EC-1细胞增殖反应检测 采用MTT法，实验根据三氧化二砷浓度分八组：64、32、、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。以每孔6×l03个细胞接种在96孔板内，细胞贴壁后，加入用上述不同最终浓度的As2O3，放入孵箱继续培养。观察24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT液20 uL，继续孵育4 h，弃内液。每孔再加入二甲亚矾，放在震荡混合仪上常温震荡10 min。在酶标仪读取492 nm的吸光度（OD），计算抑制率。实验取3个平行孔，重复3次，取平均值。抑制率（%）=1-（实验组平均OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 取在指数生长期的EC-1细胞，把细胞浓度调整为1×105/mL接种6孔培养板内，接种后24 h后，实验组加三氧化二砷处理。48 h培养后，消化离心成单细胞悬液，冷PBS洗涤两次。PBS打散制成细胞悬液，加进5 μL RNA酶（10 mg/mL），放在37 ℃水中1 h。加入50 μL碘化丙啶，30 min避光染色，400目筛网滤过后，样品在流式细胞仪在488 nm处检测。

1.3 统计学处理 采用软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 MTT法检测As2O3对EC-l的增殖抑制作用 MTT法检测不同浓度（64、32、16、8、4、2、l、0.5 μmol/L）的As2O3对食管癌EC-1细胞作用24、48、72 h后的增殖抑制作用，结果显示：随浓度升高，抑制作用增强，随作用时间延长，抑制作用增强，即存在量效和时效关系。图1可见，抑制率与As2O3浓度表现出梯度变化的曲线关系，并求出As2O3作用食管癌EC-1细胞48 h的半数抑制率（IC50）为18.74 μmol/L。图中也可见细胞抑制率为50%时对应的药物浓度大致为19 μmol/L。

图1 三氧化二砷对食管癌EC-1细胞的抑制作用

2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 为探讨As2O3对人食管癌EC-1细胞作用机制，以流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡改变及细胞周期分布的变化。表1可见As2O3可使细胞阻滞在G2/M期，使G0/G1期、S期细胞比例减少，增加细胞凋亡。

表1 不同处理组细胞凋亡检测结果（x-±s）

3 讨论

中药砒霜的主要组分即为As2O3，其用于治疗疾病已有源远流长的历史，但其毒性大，限制了在临床上的广泛使用。在上世纪70年代，国内学者应用主要成分为As2O3的癌灵1号在急性早幼粒细胞白血病疗效显著。随后更多的学者开始进行实体瘤的基础与临床研究，在食管癌方面，景绍武[12]发现As2O3能增加放疗对食管癌细胞株Eca109增殖的抑制作用。

笔者在实验中发现MTT法检测了不同浓度对食管癌EC-1细胞的增值抑制的结果显示：As2O3对食管癌EC-1细胞具有抑制增殖作用，且随时间延长，剂量增加而抑制作用更明显，即呈时效和剂效关系，与景绍武[12]用As2O3作用于食管癌细胞株Eca109的研究结果符合。

本实验经流式细胞术检测细胞周期及凋亡，结果表明 As2O3主要使细胞周期在G2/M期阻滞，G0/G1期细胞减少，与Ling等[13]同在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系，李岚[14]在胃癌BGC-823细胞研究结果符合。但也有研究报告As2O3在多发性骨髓瘤细胞中，细胞在G2/M期及G1期阻滞[15]，这可能与不同细胞系有关。综上所述，As2O3对食管癌EC-1细胞有抑制作用，为以后的动物实验和临床研究提供依据。

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