miR-370对肝细胞癌的作用及临床研究*

孙戈 嘉红云 毕肖红 余林 陈德基

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）属于临床上较为多见的一类恶性肿瘤，一般多指原发性肝癌。原发性肝癌是起源于肝脏上皮或间叶组织的恶性肿瘤，在我国的发病率较高，仅次于胃癌和肺癌。肝细胞癌目前发病机制尚不完全清楚，但大多数学者认为其与环境、生物学因素有关。在大部分研究中发现，肝炎病毒、酒精、化学性刺激、饮水污染等均会导致肝细胞癌的发生。且肝细胞癌患者早期症状不明显，出现症状检查时大多数均为中晚期，中晚期患者常出现消化道出血、肝肾衰竭以及肝脏破裂等并发症，以致错过临床最佳治疗时间，致死率极高，成为威胁人类生命安全的疾病之一[1]。在整个医学发展的过程中，人类一直在和癌症做斗争，试图彻底解决这一威胁人类生命安全的疾病。随着近年来临床对肿瘤研究的深入以及基因层面技术的发展，研究发现肿瘤的发生发展是众多因素造成的结果，其中基因因素在其中占重要部分。随着医学水平的不断提高，人们发现miRNA在肝癌细胞内常表达异常，有学者认为miRNA对肿瘤的发生发展过程中起到重要作用[2]。miRNA是一种内源性非编码蛋白质的RNA分子，首次在线虫体内发现，其具有调控编码基因表达的能力。目前已有1000多种人类miRNA分子，其中部分miRNA在人类的肿瘤疾病中起到重要作用[3]。随后大量研究证实，miR-370与多种恶性肿瘤的关系密切[4]。但是，关于miR-370与HCC的联系以及临床研究尚较少，笔者对55例HCC患者肝癌组织、癌旁组织中miR-370表达以及正常肝组织中miR-370表达进行了检测，并对比其对临床指标之间的联系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究共纳入肝癌手术患者55例，均为本院2009年1月-2015年1月收住入院的病例，均经病理诊断符合肝细胞癌诊断标准[5]。另外，25例正常肝组织来源于同时期内进行肝血管瘤手术的病例，同样经病理诊断符合血管瘤诊断标准[6]。

1.2 使用试剂 Trizol、Ambion RNA 抽提试剂盒、逆转录试剂 Super ScriptⅢ、RNA 酶抑制剂（RRI）、肝素、牛血清白蛋白（BSA）、PBS等。

1.3 标本收集 收集的新鲜组织标本均在10 min内处理，每个组织样本均先置于液氮中快速冷冻，然后置于-80 ℃冰箱内保存待用。所有肝癌组织采集后经病理检查均证实为肝癌组织，而切缘则未发现肿瘤细胞。癌旁组织采集至少距肿瘤边缘5 cm以上，并经病理检查未发现有肝癌细胞。

1.4 研究方法 采用Real-time PCR法检测肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织中miR-370水平的表达。反应体系如下：SYBR 7.5 μL、cDNA 1.0 μL、PCR primer F（10 μM）0.15μL、PCR primer R（10 μM）0.15 μL、Nuclease-Free Water 5.7 μL，总计 15 μL。反应条件如下：94 ℃预变性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环后检测溶解曲线。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行分析，计量资料用（±s）表示，比较采用两样本t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中miR-370水平表达比较 Real-time PCR结果显示，正常肝组织、癌旁组织、肝癌组织中miR-370水平分别为（0.857±0.021）、（0.003±0.001）、（0.001±0.000 01），呈现依次递减的趋势，三组间两两比较，差异均具有统计学意义（P<0.01）。

2.2 miR-370表达与HCC标本临床特性的相关性研究 根据miR-370在肝癌组织及癌旁组织中表达的中位数，可以分为高表达组与低表达组，miR-370与临床指标关系显示，miR-370低表达者在较大肿瘤、TNM分期较晚、肿瘤侵犯血管、肝内有卫星灶、肿瘤无包膜等较为多见，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 miR-370表达与HCC标本临床特性的相关性研究 例

3 讨论

HCC是目前临床较为常见的恶性肿瘤之一，于东南沿海地区发病较多，一般发病年龄在40~50岁，多见于男性，临床目前尚未对该疾病的明确发病机制做出规定。但大多数学者均表明，环境因素、肝硬化、病毒性肝炎以及相关化学致癌物质（如黄曲霉素）感染引起。患病时多表现出肝区疼痛，其作为首发症状，大多数表现出持续性刺痛、胀痛亦或是钝痛，这与肿瘤快速增长具有较强联系；其次还会发生全身性及消化道症状，例如食欲减退，消瘦乏力、腹胀腹泻、恶心呕吐等，随着病情发展，患者还可能表现出贫血及下肢水肿等症状；肝肿大及肝癌转移等[7]。目前临床治疗主要依据个体情况，对于不同阶段采用针对性综合治疗的方式，以提高整体治疗效率以及患者的生存质量。手术治疗一直是肝癌患者治疗首选方案，主要包括根治性肝切除以及姑息性肝切除术等；某些患者不宜进行手术治疗则可对其进行肝动脉化疗栓塞、激光、冷冻、微波等治疗手段；此外还可对患者进行药物治疗、放射治疗、生物治疗等[8]。

目前研究表明，miR-370与临床多种恶性肿瘤的发生、发展有着较为密切的联系[9-10]。miR-370位于人类14号染色体DLKI-DIO3印记基因区域。以往对miR-370研究发现，其主要参与了脂代谢的过程，在过程中起到调节作用。而还有研究发现，miR-370可促进miR-122表达，使二酰基甘油酰基转移酶-2以及元件结合蛋白-1c呈高表达状态，使甘油三酯聚集于肝脏[11]。而在高脂血症等肝脏疾病患者中表达程度均高于正常健康人，有学者认为miR-370可能与肝脏代谢及发育情况有关[12]。近些年来，人们对肿瘤研究的不断深入，发现肿瘤的发生是多因素调控的结果，尤其是遗传学机制在其中起到重要作用[13]。在既往的试验中，人们已经对miRNA家族有较深入的研究，发现其中miR-21、miR-221、miR-224等miRNA在肝细胞癌中均有较高表达，并可促进肝细胞癌的发生，然而目前对miR-370的研究较少。孟凡龙等[14]对miR-370研究显示，在口腔鳞状上皮细胞癌患者癌细胞中miR-370的表达低于正常健康人。在其进一步研究中发现，口腔癌患者miR-370表达越低，癌细胞越容易发生淋巴结转移。陈彪[15]的对照研究中也发现，相对于胆管细胞癌患者，正常健康人的胆管细胞中miR-370表达较高，胆管细胞癌患者癌细胞中miR-370表达明显下调。本研究对本院肝细胞癌患者及正常肝组织进行miR-370检测，结果显示，正常肝组织中miR-370存在高表达，而肝癌组织中miR-370表达较低，癌旁组织中miR-370表达则介于两者之间，上述结果呈现依次递减的趋势，可见miR-370在癌细胞中表达较低。值得注意的是，癌旁组织中miR-370表达与正常肝组织相比，已经出现了显著的降低。导致该结果的原因可能与我国大部分HCC患者是由肝硬化基础上发展而来的，因此癌旁组织并非正常的肝组织[16]。

本文分析了miR-370表达与HCC患者临床资料间的关系。结果发现miR-370表达与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤侵犯血管、肝内有卫星灶、肿瘤无包膜等有着较为密切的联系（P<0.05）。上述结果说明，miR-370表达越低，HCC患者的恶性化程度就越高。进一步说明miR-370的表达与肝癌的发生与发展过程中发挥着密切的作用。此外，miR-370低表达HCC患者更容易出现肿瘤血管侵犯、卫星灶以及包膜缺失等，说明miR-370的表达与肝癌细胞的迁移、侵袭以及血管形成等恶性生物学行为存在一定程度的抑制作用，值得临床研究的进一步深入。本研究发现miR-370的表达与AFP水平、肿瘤分化程度以及肿瘤数量等无明显的联系，这可能与本研究纳入的样本量较小以及分组间标本分布不均存在一定的关系。因此，增加样本量，平衡标本分布，能够更为准确的反应miR-370表达与HCC之间的联系。

综上所述，miR-370在肝细胞癌中呈现较低表达，表达水平较低者容易出现较大肿瘤、TNM分期较晚、肿瘤侵犯血管、肝内有卫星灶、肿瘤无包膜等。

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