响应面法优化蜂蜜酒发酵工艺

2015-04-12马文锦王贵春白艳茗

中国酿造 2015年7期

彭涛，马文锦，王贵春，金红，殷欣，张辉，白艳茗

（1.甘肃省轻工研究院，甘肃兰州 730000；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）

蜂蜜酒有近3 000年的文化底蕴，是贵族酒的一种。蜂蜜酒是以蜂蜜作为原料，经过发酵得到的酒精饮料，不仅保留了天然蜂蜜营养成分和保健功能，而且提高了氨基酸，维生素、矿物质等重要生理活性物质的含量，有很好的营养保健功效[1-3]。

我国蜂蜜年产量约为43万t，尽管产量大，但是对蜂蜜酒的研究起步较晚，生产规模小且生产厂家较少，生产工艺也比较落后，产量有限，满足不了国内外市场的大量需求，市场前景良好[4-6]。葡萄糖、果糖和蔗糖均为蜂蜜中的主要成分，可作为酵母所直接利用的发酵底物，本试验对蜂蜜酒发酵工艺进行优化，建立一套成熟的蜂蜜酒发酵工艺，最终获得品质优良的蜂蜜酒产品，以满足人们对天然蜂蜜发酵产品的消费需求，增加了蜂产品的种类，开拓蜂蜜产品消费市场，同时也为蜂产品开辟了一条新的发展途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狼牙蜂蜜（糖度75°Bx）：购于陕西省宝鸡市；酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；柠檬酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白酶：苏柯汉（潍坊）生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

PYXDHS-50型恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；LDZF-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；DK-98-I电子恒温水浴锅：余姚市东方电子仪器厂；WZ101手持糖度计：浙江托普仪器有限公司；PHS-2C型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平：奥豪斯国际贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蜂蜜酒加工工艺流程

1.3.2 发酵工艺参数优化单因素试验

初始糖度的确定：以无菌水稀释蜂蜜以达到相应的糖度，设定糖度分别为5°Bx、15°Bx、25°Bx、35°Bx、45°Bx，根据蜂蜜酒的综合评价，确定其最适发酵糖度[7]。

发酵液pH值的确定[8]：采用柠檬酸调节发酵液的pH值，分别调节至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，根据蜂蜜酒的综合评价，确定其最适发酵pH值。

发酵温度的确定：设定发酵温度为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，根据蜂蜜酒的综合评价，确定其最适发酵温度。

1.3.3 Box-Behnken中心试验设计及响应面法优化蜂蜜酒发酵工艺

在单因素试验基础上，将处理好的蜂蜜汁进行发酵，选取发酵液糖度、发酵pH值、发酵温度3个因素，以产品综合指标（Y）为响应值，进行响应面分析，响应面分析试验因素水平见表1。

表1 蜂蜜酒发酵工艺优化响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for honey wine fermentation technology optimization

1.3.4 蜂蜜酒综合评价方法

对蜂蜜酒的色泽、香气、口感和后味等感官特性及产品指标进行综合评价，满分100分，评分方法及依据综合参考国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB/T 5009.49—2008《发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法》、GB/T 4789.25—2003《食品卫生微生物学检验酒类检验》[9-11]。综合评价标准如表2所示。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜酒发酵初始糖度的确定

发酵液中糖度过高，一方面会阻遏乙醇产生途径中乙醇脱氢酶的活性而抑制发酵，不利于酒精产物的积累；另一方面会造成高渗透压环境而抑制酵母的生长[12]。发酵液糖度过小又会使酵母生长缓慢，并且糖分几乎全为酵母生长所用，酒精发酵不能正常进行，几乎不能产生酒精。蜂蜜中含糖量极高，必须予以合理的稀释，使发酵液的糖度达到合理的范围才能既利于酵母的生长又利于发酵产物的积累。由图1可以看出，在一定范围内，随着糖度的增加，蜂蜜酒的综合评分增加，随后呈现下降趋势。糖度为5°Bx时，所发酵蜂蜜酒酒香不足，口味酸涩，综合指标为60分；而糖度为25°Bx时，所发酵的蜂蜜酒清亮透明，酒味浓厚协调，甘甜爽口，蜂蜜酒品质达到较理想状态，综合指标为88分。糖度＞25°Bx时，影响酵母生长，导致成品风味不足。因此选择初始糖度25°Bx为宜。

2.2 蜂蜜酒发酵液pH值的确定

发酵液pH是影响酵母生长的重要因素，酸性或碱性过强都会抑制其生长，而酵母的生长情况是发酵工艺中的关键，直接影响产品品质，因此，合理pH值的选取至关重要。由图2可知，当pH值为3.0时，蜂蜜酒浑浊、入口蜜甜、无酒香，综合指标63分；随着pH值的增大，蜂蜜酒品质发生显著变化，当pH值为5.0时，蜂蜜酒清亮透明、酒味浓厚、甘甜爽口、后味足，蜂蜜酒品质达到较理想状态，综合指标为86分。当pH值＞5.0时，产品综合指标下降。因此选择发酵pH 5.0为宜。

2.3 蜂蜜酒发酵温度的确定

温度对发酵起着决定性的作用，直接表现为糖的消耗，间接影响口感和芳香物质的形成，温度是发酵参数控制中的重中之重[13-15]。图3为发酵温度对蜂蜜酒综合指标的影响。由图3可知，温度过高或过低都会影响蜂蜜酒的发酵，降低产品品质，当温度为25 ℃时，蜂蜜酒清亮透明，酒香浓郁，口味醇香，产品品质达到较理想状态，综合指标为84分。因此选择发酵温度25 ℃为宜。

图3 发酵温度对蜂蜜酒品质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on honey wine quality

2.4 蜂蜜酒发酵工艺优化

2.4.1 Box-Behnken中心试验设计及响应面法优化蜂蜜酒发酵工艺

Box-Behnken试验设计方案及结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计方案及试验结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

2.4.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表3中试验数据进行二次线性回归拟合，得到数学模型，并对模型进行方差分析，结果见表4，对各因素进行二次多项式回归拟合后，得到二次多项回归方程：

表4 回归统计分析结果Table 4 Results of regression statistical analysis

由表4可知，模型极显著（P＜0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.982 2），表明所建立的模型可以用来解释98.22%的响应变化，模型调整确定系数0.959 3，说明该模型能解释95.93%响应值的变化，只有4.07%的总变异没有包括其中，拟合程度较好，失拟项不显著（P＞0.01），说明本试验所得二次回归方程高度显著，能够很好地对响应值进行预测。二次项A2与C2影响极显著，B2影响显著，而发酵液糖度影响最大，且所考察因素对响应值影响不是简单的一次线性关系。

2.4.3 蜂蜜酒发酵响应面分析及优化

通过Design-Expert软件分析，得到响应面及等高线图（见图4），可直观反映各因素间的交互作用对响应值的影响，其中等高线的形状可反映出交互效益的强弱，椭圆形表示两因素之间交互作用显著，圆形则与之相反。

利用Design-Expert软件分析得到最优发酵条件，当糖度为25.06°Bx、发酵温度为24.60 ℃、pH值为5.00时，蜂蜜酒综合指标为86.1分，即各因素选取最优值后所得最大响应值。考虑到实际操作性，设定糖度为25°Bx、发酵温度为25 ℃、pH值为5.0。对以上最优工艺进行5批验证试验，综合指标平均值为86.7分，表明预测值与试验平均值结果基本一致，故确定蜂蜜酒发酵最优工艺：糖度为25 °Bx、发酵温度为25 ℃、pH值为5.0。

图4 初始糖度、发酵pH值以及温度交互作用对蜂蜜酒感官评分影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effect of interaction between initial sugar content,pH and temperature on sensory evaluation score of honey wine