[Bmim]BF4-Na2SO4双水相体系萃取葡萄皮渣中齐墩果酸

张挺峰，张喜峰*，张芬琴

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

甘肃河西走廊地处北纬36～40°，具有种植葡萄尤其是酿造葡萄的最佳光、热、水、土资源组合状态。在葡萄酒加工过程中，产生约占葡萄加工量20%～30%的皮渣废弃物，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前，已从葡萄皮渣中提取到多种多酚类物质（如天然花色苷类、原花青素、白藜芦醇、齐墩果酸等成分[1]），其中齐墩果酸为五环三萜类化合物，具有护肝降酶[2]、降脂降糖[3]、抗突变[4]、抗癌及增强免疫[5]等作用。由于齐墩果酸结构复杂，很难人工合成，多从天然产物中提取制得。因此，开展葡萄皮渣的综合利用，不仅可以获得良好的经济效益，而且能够有效地减轻环保压力，获得巨大的社会效益。

目前齐墩果酸提取方法主要有乙醇回流法[6]、微波辅助提取法[7]、超声波辅助提取法[8]、超临界萃取法[9]等。这些提取方法或存在提取效率较低、溶剂残留、毒性较大，或存在设备要求高、能耗高、成本高等缺点。近年来，由于双水相萃取技术具有高效、温和、操作简便、容易放大和能有效保持生物活性等优点，被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，涉及到细胞、膜、病毒、蛋白质、核酸等生物产品以及其他天然药物有效成分的分离和纯化[10-13]。但传统的双水相体系具有原料成本较高、高聚物回收利用困难等缺点。随着对双水相技术研究的不断深入，离子液体-盐双水相体系（ionic liquid-aqueous two phase system，IL-ATPS）具有使用温度及酸度范围宽、黏度相对较低、分相迅速、界面清晰、萃取过程不发生乳化现象、选择性和专一性较高、不使用挥发性有机溶剂以及环境友好等优点[14]。因此，利用这项技术可为从天然植物中提取有效活性成分开辟一条崭新的思路。

本研究以葡萄皮渣为原料，采用离子液体双水相体系萃取葡萄皮中齐墩果酸，分别对1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate，[Bmim]BF4）质量分数、Na2SO4质量分数、齐墩果酸质量分数、萃取温度、pH值、低级醇添加量对齐墩果酸萃取率的影响进行了研究，以期为葡萄皮渣资源深层次开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄皮渣：取甘肃滨河食品工业集团葡萄酒下脚料，经挑选、清洗、晒干，得到干净的葡萄皮渣。

齐墩果酸标准品（纯度＞99%）：国药集团化学试剂有限公司；香草醛、冰乙酸：天津百世化工有限公司；无水乙醇：安徽安特食品股份有限公司；丙酮、浓盐酸：北京化工厂；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF4）：中国科学院兰州化学物理研究所；硫酸钠（Na2SO4）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；异丙醇、正丁醇、甲醇：上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PL-203型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；XO-SM5O型超声波-微波反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；722型分光光度计：上海光谱仪器有限公司。雷磁PHSJ-5型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 齐墩果酸粗提取物的制备

准确称取50 g葡萄皮渣粉末，以1∶10（g∶mL）的料液比加入体积分数为90%的乙醇，在超声波反应系统（325 W、25 kHz）中超声5 min，5 000 r/min离心10 min，上清液为含齐墩果酸粗提液，对其进行减压浓缩，真空干燥，得到葡萄皮齐墩果酸粗提取物。

1.3.2 双水相萃取方法[14]

称取一定量[Bmim]BF4、Na2SO4、葡萄皮齐墩果酸粗提物、蒸馏水于小烧杯中，使双水相体系总质量为10.00 g，充分振荡使成相物质溶解，并调节体系pH值，静置10 min，两相达到相分离，葡萄皮渣齐墩果酸富集于双水相系统的上相中，测定葡萄皮渣齐墩果酸的上下相体积和质量浓度，其相比R、分配系数K及萃取率Y的计算公式如下：

式中：R为相比；Vt、Vb分别为上、下相体积，mL。

式中：K为分配系数；Ct、Cb分别为上、下相齐墩果酸质量浓度，μg/mL。

式中：Y为萃取率，%；R为相比；K为分配系数。

1.3.3 齐墩果酸标准曲线的绘制[15]及含量测定方法

精密称取齐墩果酸标准品0.025 g，置于250 mL容量瓶中，加入无水乙醇定容至刻度，得质量浓度为100 μg/mL的标准溶液，吸取标准溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL置于具塞试管中，于80 ℃水浴上挥去乙醇，按香草醛-高氯酸法显色，用乙酸乙酯定容至10 mL，摇匀，静置10 min，在波长547 nm处测定吸光度值。以质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，得标准曲线方程：y=0.036 2x-0.001 2（R2=0.999 5），根据回归方程计算样品中齐墩果酸含量。

1.3.4 [Bmim]BF4-Na2SO4双水相体系的确定

通过测定不同质量分数的[Bmim]BF4和Na2SO4组成的双水相体系对葡萄皮渣齐墩果酸萃取率和分配系数的影响，确定双水相体系的组成。

1.3.5 葡萄皮渣齐墩果酸萃取因素的确定

在确定了双水相体系组成后，分别研究齐墩果酸质量分数、萃取温度、体系pH值、低级醇对齐墩果酸萃取率和分配系数的影响，进而确定葡萄皮渣齐墩果酸的最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 [Bmim]BF4质量分数对葡萄皮齐墩果酸萃取效果的影响

在[Bmim]BF4-Na2SO4双水相体系中，选择质量分数分别为16%、18%、20%、22%、24%的[Bmim]BF4，与质量分数为18%的Na2SO4组成双水相体系，齐墩果酸质量分数为10%，在室温（25 ℃）条件下，搅拌使两相充分混匀，考察[Bmim]BF4质量分数对葡萄皮渣齐墩果酸萃取效果的影响，结果见图1。

图1 [Bmim]BF4质量分数对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.1 Effect of [Bmim]BF4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由图1可知，随着[Bmim]BF4质量分数的增加，葡萄皮渣中齐墩果酸萃取率Y和分配系数K都增加，当[Bmim]BF4质量分数达到18%时，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K均达到最高，分别为96.23%和16.21，此后，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K都明显下降，这是因为离子液体[Bmim]BF4咪唑环上有π电子体系能够与齐墩果酸π电子形成π-π相互作用，促使齐墩果酸转移至离子液体相中。当离子液体[Bmim]BF4质量分数过大（＞18%）时，黏度增加，影响两相传质。因此，选用[Bmim]BF4质量分数为18%进行后续试验。

2.2 Na2SO4质量分数对葡萄皮齐墩果酸萃取效果的影响

在[Bmim]BF4-Na2SO4双水相体系中，选择质量分数分别为12%、14%、16%、18%、20%的Na2SO4，与质量分数为18%的[Bmim]BF4组成双水相体系，齐墩果酸质量分数为10%，室温（25 ℃）条件下，搅拌使两相充分混匀，考察Na2SO4质量分数对葡萄皮渣齐墩果酸的萃取效果的影响，结果见图2。

由图2可知，随着Na2SO4质量分数的增加，齐墩果酸在离子液体双水相中萃取率Y和分配系数K均呈现先上升后下降的趋势，这是因为随着Na2SO4质量分数的增加，下相结构性逐渐增强，而富含离子液体的上相结构性较差，更容易形成空腔来容纳齐墩果酸[18]。当Na2SO4质量分数达到16%时，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K均达到最高，分别为96.92%和15.1。当Na2SO4质量分数＞16%以后，可能由于盐析作用，造成萃取率Y和分配系数K下降。因此，选用Na2SO4的质量分数为16%进行后续试验。

图2 Na2SO4质量分数对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.2 Effect of Na2SO4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

2.3 齐墩果酸质量分数对葡萄皮齐墩果酸萃取效果的影响

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4双水相体系中，加入齐墩果酸使其最终质量分数分别为8%、10%、12%、14%、16%，在室温（25 ℃）条件下，搅拌使两相充分混匀，考察齐墩果酸质量分数对葡萄皮渣齐墩果酸的萃取效果的影响，结果见图3。

图3 齐墩果酸对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.3 Effect of oleanolic acid concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由图3可知，随着齐墩果酸质量分数逐渐增加，齐墩果酸萃取率Y和分配系数K逐渐增加，当齐墩果酸质量分数达到10%时，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K达到最大值，分别为95.89%和15.85。齐墩果酸质量分数＞10%，萃取率Y和分配系数K呈明显下降趋势，这可能是齐墩果酸在离子液体相溶解已经达到饱和，从而增加了它在盐相中溶解量，导致萃取率Y和分配系数K的下降。因此，选用齐墩果酸质量分数为10%进行后续试验。

2.4 萃取温度对葡萄皮中齐墩果酸萃取效果的影响

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4双水相体系中，加入质量分数为10%齐墩果酸，分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃条件下搅拌使两相充分混匀，考察萃取温度对葡萄皮渣齐墩果酸的萃取效果，结果见图4。

图4 萃取温度对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由图4可知，随着萃取温度的逐渐升高，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K逐渐下降，这可能是阴离子BF4-1在较高温度条件下发生水解，导致[Bmim]BF4在离子液体相中的浓度降低，从而导致齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K逐渐下降。在室温条件下，阴离子BF4几乎不发生水解，该结果与ZAFARANI-MOATTAR M T等[19]研究结果是一致的，在萃取温度为25 ℃时，齐墩果酸的Y和K达到最大值，分别为95.2%和17.95。因此，选用萃取温度为25℃进行后续试验。

2.5 pH对葡萄皮中齐墩果酸萃取效果的影响

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4双水相体系中，加入质量分数为10%齐墩果酸，用HCl和NaOH调节体系pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，室温（25 ℃）条件下，搅拌使两相充分混匀，考察体系pH对葡萄皮渣齐墩果酸萃取效果的影响，结果见图5。

图5 p H对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.5 Effect of pH on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由图5可知，随着体系pH逐渐升高，齐墩果酸的萃取率Y和分配系数K先增大后减小，当pH值为4.0时，萃取率Y和分配系数K达到最大值，分别为93.69%和15.49。主要原因是随着pH变化，齐墩果酸和离子液体之间静电平衡被破坏，因齐墩果酸为一元有机弱酸HA，易导致有机酸解离HA≒H++A-，为使分子形式的齐墩果酸存在于离子液体相，电离平衡必须向左进行，因此，双水相体系必须有一个酸性环境。因此，选择体系pH值为4.0进行后续试验。

2.6 低级醇对葡萄皮中齐墩果酸萃取率效果的影响

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4双水相体系中，加入质量分数为10%齐墩果酸，分别加入体积分数为2%的甲醇、无水乙醇、异丙醇和正丁醇，调节体系pH值为4.0，在室温（25 ℃）条件下，搅拌至两相充分混匀，考察低级醇对葡萄皮渣齐墩果酸萃取效果的影响，结果见图6。

图6 低级醇对齐墩果酸萃取效果的影响Fig.6 Effect of short-chain alcohol on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由图6可知，在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4体系中，与不加醇比较，无水乙醇的加入使得萃取率Y和分配系数K最大，分别为97.86%和16.29。这可能是[Bmim]BF4的极性与无水乙醇最为相似，而甲醇、异丙醇、正丁醇的加入反而使得萃取率Y和分配系数K降低，是由于低级醇的加入，取代了体系中的一部分水，使相间界面张力及电位差发生了变化，从而改变了齐墩果酸在两相间的分配。因此，选择在[Bmim]BF4-Na2SO4体系中加入体积分数2%无水乙醇。

3 结论

采用[Bmim]BF4-Na2SO4双水相体系萃取葡萄皮中齐墩果酸，考察了[Bmim]BF4、Na2SO4质量分数、齐墩果酸质量分数、萃取温度、pH、低级醇对葡萄皮齐墩果酸萃取过程中分配系数K及萃取率Y的影响，确定离子液体双水相萃取葡萄皮中齐墩果酸的最佳条件：在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4双水相体系中，室温（25 ℃）条件下，加入质量分数10%齐墩果酸、体积分数2%无水乙醇，调节体系pH 4.0，齐墩果酸萃取率Y为97.9%，分配系数K为16.58。

离子液体双水相萃取技术具有体系相间张力较低、分离条件温和、可控制乳化现象等优点，使得离子液体/盐双水相的实际应用更具现实可能性，有望开辟萃取技术应用的新途径。但人们对分离体系中各组分在离子液体-双水相体系（IL-ATPS）中的相互作用、各组分的分配情况及其机理的了解还不深入和全面，因此迫切需要对萃取分离方面进行系统的理论和应用研究，使之形成完善的体系。

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