超声波辅助萃取-气相色谱法测定青椒中有机磷农药残留的研究

颜 琪

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

青椒营养价值高，富含VB、VC、胡萝卜素等，尤其是VC的含量是番茄的7～15倍，具有促进消化、预防癌症等功效[1]。有机磷农药是继有机氯农药以后被广泛使用的一类高效、广谱的化学杀虫剂，因其易降解、价格低廉等特点[2]在农业生产中得到了广泛的应用。目前生产使用的多为高效低毒低残留的品种（如敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷等[3]）。

虽然农药的施用可以有效提高蔬菜制品的质量品质，但是蔬菜中农药残留超标会对人体造成急、慢性中毒，引起神经紊乱、精神失常等病症，导致癌症、畸形、突变等危害[4]。蔬菜的安全问题尤其是农药残留问题已经引起了各国政府的高度重视和社会公众的广泛重视。旨在保障公众身体健康和生命安全的《中华人民共和国食品安全法》中，农产品的农药残留检测项目日益增多、限量要求日益严格[5-6]。因此，对蔬菜中农药残留进行检测，是食品卫生与安全监督的重要环节，也是高效、合理使用农药的技术保障，对降低蔬菜中农药残留、中毒事件的发生，保障人民身体健康具有重要意义。

目前，有机磷类农药检测方法有光谱法、试纸法技术、色谱法、免疫学方法、生物传感器与生物芯片技术[7-9]。由于有机磷农药大部分具有较好的挥发性，且气相色谱法的检测器灵敏度高，是对有机磷类农药最有效的分离手段[10]。本研究采用超声波辅助萃取-气相色谱法，旨在建立安全有效萃取青椒中5种有机磷农药的技术方法，通过响应面试验优化有机磷农药溶剂萃取条件，得到最优的技术参数，达到有效提高农药提取率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

随机抽取市售青椒50份。

农药标准品：（1）标准溶液储备液：敌敌畏（dichlorvos）、甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧乐果（omethoate）、倍硫磷（fenthion），质量浓度为100 μg/mL；（2）混合标准溶液：分别取有机磷类农药标准溶液储备液，以丙酮定容，配制成质量浓度为5.00 mg/kg的混合标准溶液，再逐渐稀释成0.50 mg/kg、0.05 mg/kg。

丙酮（色谱纯，经重蒸）、乙腈（色谱纯）、氯化钠（分析纯，140 ℃烘烤4 h）：天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 6890气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；XH-B漩涡混合器：姜堰市康健医疗器具有限公司；N-EVAP氮吹仪：美国Organomation公司；H09-T25匀浆机：德国IKA集团；ME梅特勒分析天平：武汉宏锦科技有限公司；0.2 μm微孔滤膜：天津富集科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

将抽取的青椒样品取可食部分，切碎，充分混匀，以四分法取样，放入5.00 mg/kg有机磷混合标准农药中浸泡15 min，阴暗处放置24 h备用。

1.3.2 有机磷农药检测方法

（1）有机磷农药的测定方法

参考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[11]的方法并予以改进：准确称取25.0 g青椒试样，加入一定体积的乙腈，在匀浆机中高速匀浆2 min后，超声提取一定时间，通过滤纸过滤至装有5～7 g氯化钠[12]的100 mL具塞量筒中，涡旋振荡1 min，室温条件下静置30 min使其分层。从具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈，一定水浴温度条件下氮吹蒸发至近干，最后用丙酮定容至2.0 mL，0.2 μm滤膜过滤。以保留时间定性，峰面积外标法定量，在相同色谱条件下，分别将标准溶液及样品溶液经气相色谱分析。

（2）气相色谱测定条件

色谱柱：聚苯基甲基硅氧烷（DB-17）色谱柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；进样口温度：220 ℃；进样方式：不分流进样；检测器：火焰光度检测器（温度为250 ℃）；柱温：150 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速度升至250 ℃保持12 min；载气：氮气流速为10 mL/min；进样量1.0 μL。

（3）回收率的计算

式中：X为试样中实测有机磷农药的含量，mg/kg；A为试样所含有机磷农药的含量，mg/kg；B为加入标品量，mg/kg。

1.3.3 有机磷农药溶剂萃取条件的优化

表1 萃取条件优化响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment for extraction condition optimization

在单因素试验基础上，选定超声时间、料液比和水浴温度对有机磷农药萃取效果影响显著的3个因素进行优化，根据中心旋转组合设计和数据处理，确定最佳萃取条件。选取超声时间（A）、料液比（B）、水浴温度（C）为试验因子，以有机磷农药的回收率Y为响应值，试验因素与编码水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 样品的预处理

样品预处理过程中采用匀浆、过滤和振荡的方法，通过这些方法可以增加农药残留量的提取率。有机磷类农药的测定中，用乙腈与丙酮作为农药提取剂及分配净化剂[13]。李四生等[14]认为提取中采用盐析作用有利于两相分层，提高有机磷农药在有机相中的分配系数，从而提高萃取率。故本试验采用加入过量的氯化钠，更加有利于乙腈从水相中分离出来，从而提高有机磷农药在乙腈中的浓度。用氮吹仪代替旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩效率高，农药损失率低，溶剂处理量小[15]。

2.2 色谱条件

色谱柱类型、柱温度、载气流速是影响气相色谱分离效果、分析时间长短和方法灵敏度的主要因素[16]。本试验农药残留的检测中，如果选用恒温，则农药出峰时间长，峰形差，不能得到有效分离。因此采取程序升温，能兼顾高、低沸点组分的分离效果和分析时间，使不同沸点的组分基本上都能在其较合适的柱温条件下进行分离。色谱柱选择聚硅氧烷类，其极性范围广（从弱极性到强极性），选择性强，能满足多种有机磷农药残留的分析测定[17-18]。

2.3 检测方法可靠性分析

2.3.1 有机磷农药检测方法

图1 5种有机磷农药标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solutions of five organophosphorous pesticides

按上述气相色谱条件分析测定，5种有机磷农药混合标准样品色谱图见图1，可以看出，敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、倍硫磷在其保留时间（分别为2.249 min、2.784 min、4.533 min、5.310 min、5.717 min）处都具有明显而尖锐的峰，峰形对称，基线平稳，5种农药在6 min内可获得良好分离。其中的杂峰基本上对标样的组分没干扰，分离效果好。说明采用的检测条件合适，方法可行。

2.3.2 方法的精密度、准确度及灵敏度

测定方法的准确度、精密度和灵敏度分别以全过程的加标回收率、相对标准偏差（relative standard deriation，RSD）及检出限衡量。按1.3.2检测方法，在25.0 g青椒试样中分别添加质量浓度为0.05 mg/kg、0.50 mg/kg、5.00 mg/kg的5种有机磷农药混合标准溶液1 mL进行加标回收率试验，测出回收率并计算相对标准偏差。加标回收率、相对标准偏差及检出限结果见表2。

表2 5种有机磷农药的检出限、加标回收率与相对标准偏差Table 2 Limit of detection,recovery rates and RSD of five organophosphorous pesticides

由表2可以看出，5种有机磷农药的平均回收率为78.6%～93.6%，RSD≤5.2%，检出限范围为0.008～0.015 mg/kg，方法的回收率较高，相对标准偏差较低，检出限符合对农产品中农药残留检测的要求[19]。说明该方法具有良好的准确度、精密度和灵敏度。采用本试验的检测方法检测这5种农药在青椒中的残留量是可行的，均可达到定量分析的要求，方法准确可靠。

2.4 响应面法优化有机磷农药的溶剂萃取条件

2.4.1 回归方程及方差分析

以有机磷农药的回收率作为响应值，对超声时间（A）、料液比（B）、水浴温度（C）进行3因素3水平响应面中心组合试验设计，结果见表3，方差分析见表4，模型可信度分析见表5。

由表3、表4所得的多项式回归模型为：Y=-241.74+10.31A-21.64B+7.46C-0.11AB-0.087AC+0.45BC-0.13A2-3.78B2-0.045C2。该模型在α=0.01的水平上高度显著，失拟项不显著（P＞0.05）。根据回归方程各个系数绝对值的大小可判断3个因素对有机磷农药的回收率的影响顺序为料液比＞超声时间＞水浴温度。

表3 萃取条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment for extraction condition optimization

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

表5 模型可信度分析Table 5 Reliability analysis for model

由表5可知，复相关系数R2=0.910 3，表明有机磷农药回收率响应值的0.910 3是由所选变量超声时间、料液比、水浴温度引起，回收率的实际值与理论预测值之间具有较好的拟合相关性。变异系数（coefficient of variation，CV）越低，试验的可信度和精确度越高，CV值等于3.72%，表示该试验的可信度和精确度较高。综上所述，所得回归方程为有机磷农药溶剂萃取条件的优化提供了合适的模型，可代替真实试验点对农药回收率进行预测。

2.4.2 响应面分析及最优萃取条件的确定

对超声时间、料液比及水浴温度3个因素，进行两两交互作用分析，得到响应面图（反映各个试验因素对响应值的影响程度）和等高线图（反映最佳条件下各个试验因素的值）。从图2可以看出，超声时间和水浴温度、料液比和水浴温度的交互作用显著，超声时间和料液比交互作用不显著。

图2 超声时间、料液比与水浴温度交互作用对回收率影响的响应面及等高线图Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic time,solid-liquid ratio and water bath temperature on recovery rate

对所得的回归模型进行数学分析，得出有机磷农药的最佳萃取条件为超声时间13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴温度76.7 ℃。在此最优萃取条件下，有机磷农药的回收率理论值为97.05%。

2.4.3 验证试验

为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件萃取有机磷农药，实际测得到的回收率为96.82%，与理论值相比，误差为0.23个百分点。因此，该模型合理有效，采用响应面分析优化得到的最优萃取条件参数真实可靠，可用于实际操作。

3 结论

本研究采用超声波辅助萃取-气相色谱法，旨在建立安全有效地萃取青椒中5种有机磷农药的技术方法，通过响应面试验优化有机磷农药溶剂萃取条件，得到最优的技术参数，各因素对回收率的影响次序是：料液比＞超声时间＞水浴温度；通过中心组合设计及响应面分析获得的最佳工艺参数为超声时间13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴温度76.7 ℃，理论回收率为97.05%，实测值为96.82%。该方法相对标准偏差是2.1%～5.2%，检出限的范围是0.008～0.015 mg/kg。所得的优选方法为有机磷农药溶剂萃取条件提供了拟合度很高的模型，更准确地代替真实试验点对回收率进行预测，具有一定的实际应用性。与传统方法相比，该法操作简便，提高了分析效率及检测灵敏度，适用于大批量检验工作，进一步为有机磷农药的检测研究提供一定基础，对确保公众食用安全放心的青椒具有重要的现实意义。建立的5种有机磷农药残留的检测方法可行，适于推广。

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