白酒中甜味剂的检测及其来源的探讨

2015-04-12冯永渝梁桂娟

中国酿造 2015年7期

孙棣，冯永渝，梁桂娟

（贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550004）

我国白酒有几千年的历史，在酒类产品中，白酒行业所创造的效益一直名列前茅，并带动了相关产业的发展。通过监测发现，白酒中甜味剂的使用不是偶然情况，在白酒中加入甜味剂以增加白酒的甜味和回甜感，改善口感已成为白酒行业的潜规则。目前，广泛应用的人工合成甜味剂主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精钠、安赛蜜等，甜味剂是人工合成的非发酵物质，各香型白酒国家标准中规定不得添加甜味剂[1-5]。

目前食品中检测甜味剂的方法主要有气相色谱法（gas chromatographic，GC）[6-8]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[14-16]等。国标中甜味剂的检测方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法，但这些方法检测限高，且国家标准GB/T 5009.97—2003《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》甜蜜素的检测方法因易出现假阳性结果已被卫生部监督司列入不适合白酒检测范围。在实际监测工作中发现，微量甚至痕量的甜味剂即可改善白酒的口感，而传统的色谱法并不能有效地对白酒中的微量甜味剂进行监控。

为了找到对白酒中几种甜味剂的检出限和适宜的本底值，明确判定准则，分清产品因素、人为因素和环境因素所带来的影响，本研究建立了快速、灵敏、准确的同时检测白酒中4种甜味剂的高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测方法，并进行了大量白酒样品中甜味剂的检测，对白酒生产过程中的甜味剂产生的可能原因进行了分析，为食品安全监管工作提供技术支持，保障白酒的食品安全和质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原酒、成品酒、曲药、香料：生产企业库房抽取；安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖标准品（纯度均＞98.5%）：德国Dr.Ehrensforfer GmbH公司；甲醇（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）：德国Merck公司；0.22 μm微孔滤膜：上海信步科技有限公司。

1.2 仪器与设备

4000QTRAP三重四极杆质谱仪：美国AB Sciex公司；Agillent1260高效液相色谱仪：美国Agillent公司；N60M氮气发生器：美国PEAK公司；UVS-1振荡混匀器：德国Heielolph公司；Milli-Q Academic超纯水系统：密理博（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品储备溶液和使用溶液的配制

精确称取安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖标准品0.100 0 g，用超纯水溶解后定容至100 mL容量瓶中，制备成质量浓度为1 mg/mL的混合标准储备液，4 ℃保存。

将上述混合标准储备液逐级稀释，用超纯水配制质量浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合标准使用溶液。

1.3.2 样品前处理

酒样（液体样品）：取2.0 g样品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸馏水涡旋混匀后，用水定容至刻度，混匀后过0.22 μm微孔滤膜待测。

曲药、香料（固体样品）：取2.0 g样品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸馏水涡旋混匀后超声提取30 min，取出放至室温后用水定容至刻度，混匀后滤纸过滤，将滤液过0.22 μm微孔滤膜后进样测定。

1.3.3 仪器条件

质谱条件：电喷雾（electronic spray ion，ESI）离子源；采用负离子模式；离子监测采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；电喷雾电压（spray voltage，SV）5 500 V，喷雾气（GS1）、辅助气（GS2）、气帘气（CUR）流速分别为60 L/h、60 L/h、35 L/h。喷雾气温度为650 ℃。定性、定量离子对、锥孔电压、碰撞电压等参数见表1。

表1 MRM监测模式的优化条件Table 1 The optimum conditions of MRM mode

高效液相色谱条件：色谱柱Agillent EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；流动相为0.01 mol/L乙酸铵水溶液/甲醇；梯度洗脱，具体条件见表2；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

表2 流动相梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的确定

参照行业标准SN/T 1948—2007《进出口食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中前处理方法，取酒样直接进样，发现回收率只有30%左右，这可能是因为酒样中含有酒精等物质产生的基质效应，从而引起回收率偏低。考虑到白酒样品本身的基质效应，取酒样在水浴锅上挥干，用纯水定容进样，发现回收率达到90%以上，也证实了酒样的基质效应，但该法在挥干酒精的过程中耗时较长，步骤繁琐，后来对方法进行了改进，通过直接用超纯水稀释10倍后进样，发现该方法回收率为95%左右，大大降低了白酒的基质效应、方法简便快速。

对于曲药，香料等固体物质采用超声法将水溶性甜味剂提取到水溶液中，通过过滤净化后进样，方法简便，回收率＞90%，适用于固体样品中甜味剂的前处理。

2.2 色谱条件的选择

从不同流动相对待测物质在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度和保留时间等的影响为考察指标，对水-甲醇体系和乙酸铵-甲醇体系进行了比较，结果发现，乙酸铵-甲醇体系分离4种甜味剂时分离度、峰形、灵敏度以及保留时间的稳定性均优于水-甲醇体系。这是由于乙酸铵是缓冲溶液，可提高待测物质的离子化效率，同时又可作为离子对试剂提高待测物质在反相色谱柱上的保留时间，从而改善其在液相色谱中的保留行为[17]。因此本试验选择乙酸铵-甲醇体系作为流动相。4种物质的色谱图如图1所示。

图1 四种甜味剂的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of the four kinds of sweeteners

由图1可知，经过色谱条件的优化，4种物质峰型尖锐对称、灵敏度高、专属性强，且在6 min内可以完成全部物质的同时测定，因此该方法具有简便、快速、准确的特点。各物质的MRM色谱图见图2。由图2可知，4种甜味剂在Agillent EC-C18上有较好保留，且峰形对称。

图2 安赛蜜(A)、糖精钠(B)、甜蜜素(C)、三氯蔗糖(D)的MRM色谱图Fig.2 Multiple reactions monitoring chromatograms of acesulfame(A),saccharin sodium (B),sodium cyclamate (C) and sucralose (D)

2.3 标准曲线及方法检出限

配制5ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL的混合标准使用溶液进行测定，绘制标准工作曲线。并根据信噪比S/N=3确定了4种甜味剂的检出限，结果如表3所示。

表3 4种甜味剂的线性方程及检出限Table 3 Linear equation and detection limits of the four kinds of sweeteners

从表3中可以看出，4种化合物在5～100 ng/mL线性范围内线性良好，相关系数R2≥0.998 6，检出限达到10-9级，方法灵敏度高。

2.4 方法的精密度和回收率试验

向白酒样品中分别添加4种甜味剂的高（50 ng/mL）、中（10 ng/mL）、低（5 ng/mL）3个质量浓度水平的标准溶液，进行精密度和回收率试验，将每个质量浓度样品平行测定6次，测定结果见表4。

表4 4种甜味剂的加标回收率和精密度试验结果(n=6)Table 4 Recovery rates and precision test results of four sweeteners (n=6)

由表4可知，4种甜味剂的物质在高、中、低3个质量浓度水平的精密度试验中相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.09%～4.64%，表明结果精密度良好，回收率在82.7%～117.62%，表明结果准确度高。结果表明，该方法能够满足白酒中安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖4种甜味剂的检测需要。

2.5 不同样品中甜味剂的检测结果及其来源分析

应用本方法对成品酒、自产轮次酒、基酒、外购基酒、外购调味酒、自产曲药、外购糖化酶等22个批次样品进行了跟踪检验排查，结果见表5。

表5 样品中4种甜味剂的检测结果Table 5 Determination results of four sweeteners in samples mg/kg

由表5可知，企业自身生产的成品酒、轮次酒及生产所用到曲药和糖化酶的甜味剂检出量非常低，远远低于国家标准检出限（甜蜜素0.1 mg/kg、糖精钠1.0 mg/kg、安赛蜜4.0 mg/kg、三氯蔗糖4.0 mg/kg），企业按照正常工艺生产，甜味剂的本底值是很低的，不存在误判风险。

发现其外购的调味酒含有较高的甜味剂，其中甜蜜素含量为810.68 mg/kg，糖精钠为405.34 mg/kg，远远超出国家标准规定的检出限，从而导致成品酒中的甜味剂含量超标。

本研究针对调味酒进行检测，在本省获证白酒企业抽取调味酒13个批次进行追踪检验，其中11个批次调味酒检出甜味剂，甜蜜素检出11个，其中7个超过0.1 mg/kg的国家标准规定的检出限，糖精钠检出11个，其中1个超过1.0 mg/kg的国家标准规定的检出限；安赛蜜检出3个，其中1个超过4.0 mg/kg的国家标准规定的检出限；三氯蔗糖检出1个，没有超过4.0 mg/kg的国家标准规定的检出限，这也表明调味酒是带入白酒甜味剂的主要原因，外购调味酒是造成成品酒甜味剂超标的较大的风险源。

对浓香型白酒及酱香型白酒的自产新酒样、组合基酒、盘勾酒样、酱香醇甜酒、待装成品酒样、典型成品酒样、自产高温大曲、中温大曲等41个样品进行检验排查，所有酒样均未检出甜味剂，在高温大曲、中温大曲中均检出甜蜜素含量为0.03 mg/kg左右，其他甜味剂均低于方法检出限。

对其他获证企业自产或外购糖化酶采样23个批次，进行了4种甜味剂的检测，均检出的低含量的甜蜜素和糖精钠，其中，曲药中甜蜜素检测范围在0.031～0.10 mg/kg，糖精钠检测范围在0.007～0.040 mg/kg，这可能是曲药在自身的发酵过程中会产生干扰物质，从而导致成品酒中甜味剂本底值的产生。但曲药和成品酒的检出值均低于行业标准SN/T 1948—2007《进出口食品中环己基氨基磺酸钠的测定》规定的0.1 mg/kg的检出限。

采用本方法对市售可能添加到白酒中的10个香料物质进行4种甜味剂的检测，香料中4种甜味剂均未检出。白酒生产中按固态发酵工艺生产不会引起甜味剂超标，但是通过外购基酒调味酒的方式却会增大甜味剂检出的风险，企业应采取有效手段对外购酒样的质量进行控制，以保证白酒生产质量安全[18]。

3 总结

本研究建立了同时、快速检测白酒及曲药中安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖等4种甜味剂含量的高效液相色谱-质谱联用检测方法。白酒样品经过超纯水稀释10倍后直接进样，采用甲醇-乙酸铵溶液为流动相进行检测，4种甜味剂在6 min内可达到完全分离，在5～100 ng/mL范围内呈良好线性关系（相关系数R2≥0.998 6），检出限为0.005～0.02 mg/kg，回收率为82.7%～117.62%，相对标准偏差为1.09%～4.64%，表明该方法灵敏度高、精密度及准确性良好。同时通过对白酒生产工艺的整个流程进行跟踪检测，发现曲药在自身的发酵过程中会产生类似甜蜜素的干扰物质，从而导致成品酒中检出微量甜蜜素。结果表明，该检测方法快速灵敏，大大缩短了检测周期和检测成本，能够及时为质监部门提供执法的科学依据。

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