酶联免疫法与液相色谱-串联质谱法检测猪肉中沙丁胺醇

何方洋，于信念，王 坤，王兆芹

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京 102206；3.金元证券股份有限公司，广东 深圳 518048）

沙丁胺醇是一种β-受体兴奋剂药物，常用于支气管哮喘以及哮喘性支气管炎等呼吸系统疾病的治疗[1]。由于沙丁胺醇能够减少动物的脂肪沉积、提高其瘦肉率、促进动物生长，因此被不良养殖者非法使用。如果食物中残留沙丁胺醇，那么可导致人体心悸、发烧、头痛、恶心、战栗等症状，对消费者的身体造成伤害[2-3]，因此，各国政府都严禁沙丁胺醇用作饲料添加剂，我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β-受体兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食品动物[4]。

目前，对于沙丁胺醇的残留检测主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatograph，HPLC）法、液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS）联用分析法[5-6]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[7-9]、毛细管区带电泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）[10-12]、酶联免疫测定（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA）法[13-15]、胶体金免疫层析方法（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）等检测方法[16-18]，仪器检测方法具有检测精确度高的优点，但其仪器化程度高，样品处理较复杂、检测费用高，难以对样品进行大量测定，而酶联免疫检测方法对实验人员要求较低，操作简单、快速，无需大型仪器，特异性也较高，可同时检测大量样品，因此本研究采用酶联免疫检测方法（ELISA）和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem spectrometry，LC-MS/MS）法测定猪肉样品中沙丁胺醇的残留量，对比分析这两种方法的检测限、准确度、精密度，由此评估酶联免疫法检测沙丁胺醇的准确性，为快速检测方法的推广使用提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉：市购。

沙丁胺醇标准品：美国Sigma 公司；沙丁胺醇试剂盒（其中包括包被有沙丁胺醇偶联抗原的96孔酶标板、6种质量浓度的沙丁胺醇标准品和1瓶高质量浓度标准品、酶标二抗浓缩液、抗体工作液、浓缩洗涤液、样本稀释液、底物液A液和B液、终止液）：北京勤邦生物技术有限公司；三氯乙酸、乙酸铵、高氯酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲酸水溶液、氨水甲醇溶液、β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶均为分析纯：北京百欣试剂公司。

1.2 仪器与设备

Alliance2695/Quattro液相色谱-串联质谱仪：美国Waters公司；DSY-Ⅲ氮吹仪：北京金科精华苑科技有限公司；Anke TDL-40B 低速离心机：上海安亭科学仪器有限公司；90-2 磁力搅拌器：上海振荣科学仪器有限公司；微量移液器（单道20～200 μL、100～1 000 μL、多道250 μL）、MK3酶标仪：美国Thermo公司；DHP-600 生化培养箱：天津市中环实验电炉有限公司；2000SBL 电子天平：美国Setra公司；QL-901 漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；8010S 匀浆机：上海斯伯明仪器设备有限公司；KS-Ⅱ振荡器：上海跃进医疗器械厂；DKZ-2 电热恒温振荡水槽：杭州汇尔仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

（1）酶联免疫法样品前处理方法

向（2.0±0.05）g猪肉均质样品中加入3%三氯乙酸2 mL，涡动5 min，4 000 r/min室温（20～25 ℃/68～77 ℉）条件下离心5 min；取上清液500 μL，加入0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）500 μL，充分混匀（pH值应在7～9），取50 μL用于酶联免疫法分析。

（2）液相色谱-串联质谱方法的样品前处理方法

猪肉样品按照国标农业部1025号公告—18—2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》（检测限为0.25 μg/kg）中的操作方法进行样品前处理[19]。

1.3.2 酶联免疫方法测定沙丁胺醇方法

取出微孔板，向微孔中加入50 μL 沙丁胺醇标准品/处理好的样品，然后加入抗体工作液：酶标二抗浓缩液（10∶1，V/V）50 μL，混匀，避光环境25 ℃下反应30 min；用洗涤工作液250 μL/孔洗涤微孔板，然后加入50 μL底物液A液，再加入50 μL底物液B液，混匀，避光环境25 ℃下反应15 min。最后加入50 μL终止液，混匀，设定酶标仪于波长450 nm处测量每孔的吸光度值。

1.3.3 ELISA测定沙丁胺醇标准曲线的绘制及样品沙丁胺醇含量的计算

标准品或样本的百分吸光率的计算公式如下：

式中：B为标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值；B0为空

白（浓度为0标准溶液）的吸光度值。

以标准品溶液的百分吸光率（y，%）为纵坐标，以沙丁胺醇标准品质量浓度（x，μg/L）的对数为横坐标绘制标准曲线，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的质量浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中沙丁胺醇实际残留量。

1.3.4 液相色谱-串联质谱测定条件

（1）液相色谱条件

表1 流动相及梯度洗脱条件Table 1 The conditions of mobile phase and gradient elution program

（2）质谱条件

质谱测定条件见表2。

表2 质谱测定条件Table 2 The condition of mass spectrum

1.3.5 液相色谱-串联质谱法标准曲线的绘制及样品浓度的计算

取阴性猪肉添加一定质量浓度的沙丁胺醇标准溶液，按上述方法处理，经液相色谱-串联质谱法分析，得到峰面积。以沙丁胺醇特征离子质量色谱峰面积（y）为纵坐标，以阴性猪肉添加的沙丁胺醇标准品质量浓度（x）为横坐标，绘制LC-MS/MS标准曲线，并采用外标法定量。将样品的峰面积代入标准曲线中，从而读出样品所对应的质量浓度即为样品中沙丁胺醇实际残留量。

1.3.6 准确度和精密度实验

分别以回收率和变异系数（coefficient of variation，CV）表示准确度和精密度。称取阴性猪肉2.0 g置于50 mL聚丙烯离心管中，分别添加沙丁胺醇标准品至终质量浓度为1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg。然后利用酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法测定沙丁胺醇残留量的回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 ELISA测定沙丁胺醇标准曲线

按照沙丁胺醇标准曲线制作步骤，分别测定沙丁胺醇标准品质量浓度为0、0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L的吸光度值，经ELISA分析，利用RIDAWIN数据分析软件建立标准曲线，结果见图1。

图1 沙丁胺醇ELISA测定标准曲线Fig.1 Standard curve of salbutamol determined by ELISA

由图1可知，标准曲线回归方程为y=-2.224 8x-0.815 2，相关系数R2=0.992 8，其中半抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）值为0.366 μg/L，表明二者线性良好。

2.2 LC-MS/MS测定沙丁胺醇标准曲线

图2 沙丁胺醇LC-MS/MS测定标准曲线Fig.2 Standard curve of salbutamol of LC-MS/MS determined by LC-MS/MS

分别取阴性猪肉样品添加沙丁胺醇标准品质量浓度为0、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L，按上述方法处理，经液相色谱-串联质谱法分析，绘制标准曲线见图2。

由图2可知，标准曲线回归方程为y=2 303.89x，相关系数R2=0.997 37，表明二者线性良好。

2.3 准确度和精密度

常用回收率评估方法准确度，用变异系数评估方法精密度，酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法测定准确度和精密度实验结果分别见表3和表4。

表3 ELISA方法测定的准确度和精密度实验结果Table 3 Determination results of accuracy and precision tests by ELISA

表4 LC-MS/MS法测定的准确度和精密度实验结果Table 4 Determination results of accuracy and precision tests by LC-MS/MS

由 表3、表4 可 知，分 别 添 加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg 3个浓度水平的沙丁胺醇标准品的猪肉样品，酶联免疫法的平均加标回收率分别为83.7%、90.2%和90.9%；变异系数为5.4%～10.3%，液相色谱-串联质谱法的平均加标回收率分别为86.6%、88.6%和93.5%，变异系数为6.0%～8.3%。两种方法加标回收率在83.7%～93.5%，变异系数＜10.3%，由此得出酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法的准确度及精密度均较好。

2.4 检测限

2.4.1 酶联免疫法

通过标准曲线得到20个空白猪肉样品的沙丁胺醇质量浓度。利用公式：检测限=X+3s（X为重复测定空白样品的平均值，s为重复测定空白样品的标准差），得到该方法的检测限为0.5 μg/kg。

2.4.2 液相色谱-串联质谱法

最低检测限按照信噪比3∶1 计算，得到该方法的检测限为0.25 μg/kg。

2.5 ELISA法和LC-MS/MS法检测实际样品结果

利用ELISA法检测70份猪肉样品，2份疑似阳性猪肉样品（沙丁胺醇质量浓度＞0.5 μg/kg）被筛选出，用LC-MS/MS法确证这2份疑似阳性猪肉样品均为阳性，结果见表5，阳性猪肉样品中沙丁胺醇的液相色谱-串联质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）色谱图见图3。

图3 阳性猪肉样品1(A)及样品2(B)中沙丁胺醇的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of salbutamol in positive pork sample 1(A) and 2(B)

表5 酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法检测结果比较Table 5 Determination results of ELISA and LC-MS/MS

由表5可知，酶联免疫方法和液相色谱-串联质谱法测定沙丁胺醇残留量结果基本一致，并且酶联免疫方法的假阳性率为0，因此，适用于猪肉产品中沙丁胺醇残留量检测的快速筛选。

3 结论

目前，酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法是测定动物组织中沙丁胺醇残留量时的常用方法。两者的区别在于：酶联免疫法能够对动物源性食品中沙丁胺醇残留进行快速大量筛选，检测时间仅为1～2 h，主要作为一种快速筛选手段，在现场监控和基层检测中广泛使用。但由于快速筛选方法的国家标准或行业标准很少，因此给检测结果判定带来一定困难。而液相色谱-串联质谱方法更为准确、灵敏，适合对快速检测方法的结果进行确证。

本研究利用酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法测定猪肉样品中沙丁胺醇药物残留量，结果表明，1.0～4.0 μg/kg添加猪肉样品时酶联免疫法回收率为83.7%～90.9%，变异系数为5.4%～10.3%，检测限为0.5 μg/kg；液相色谱-串联质谱法的平均回收率分别为86.6%～93.5%，变异系数为6.0%～8.3%，检测限为0.25 μg/kg。酶联免疫法适用于进行猪肉样品中沙丁胺醇的快速筛选，液相色谱-串联质谱法适用于阳性样品的确证和精确定量。

[1]陈新谦，金有豫.新编药物学（14 版）[M].北京：人民卫生出版社，1999.

[2]刘宣兵，庞玉芳，侯玉泽，等.沙丁胺醇的毒副作用及其残留检测[J].上海畜牧兽医通讯，2008，53（4）：83-85.

[3]栗 艳.“瘦肉精”的危害及防治[J].中国畜牧兽医文摘，2011，27（4）：175.

[4]中华人民共和国农业部兽医局.食品动物禁用的兽药及其它化合物清单[EB/OL].http://www.moa.gov.cn/sjzz/syj/dongtai/201006/t20100606_1535262.htm，2002-04-09.

[5]DAVID C J,KENARL D,GEORGE D,et al.The analysis of β-agonists by packed-column supercrltical fluid chromatography with ultraviolet and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection[J].Analysis,1999,124:827-831.

[6]梁晓聪，程国霞，朱参胜.GC/MS 法同时测定动物组织中4 种β-兴奋剂残留量[J].中国卫生检验杂志，2008，18（2）：199-210.

[7]孟 娟，邵 兵，吴国华，等.气相色谱-质谱法同时测定动物性食品中8 种β-兴奋剂的残留量[J].中国卫生检验杂志，2005，15（6）：641-643.

[8]SPISSO B F,LOPES C C,MARQUES M A,et al.Determination of β2-agonists in bovine urine comparison of two extraction/clean-up procedures for high-resolution gas chromatography-mass spectrometry analysis[J].J Anal Toxicol,2000,24(2):146-152.

[9]朱 坚，李 波，方晓明，等.气相色谱-质谱法测定肝、肾和肉中11种β2-受体激动剂残留量[J].质谱学报，2005，26（3）：129-137.

[10]陈红青.高效毛细管电泳法用于饲料中盐酸克仑特罗与沙丁胺醇含量的测定[J].福州大学学报：自然科学版，2003，31（5）：615-617.

[11]段建平，陈红青，陈 颖，等.毛细管区带电泳法同时测定饲料中西马特罗、盐酸克仑特罗和沙丁胺醇[J].色谱，2005，23（3）：261-263.

[12]颜流水，温振东，井 晶，等.猪肝中克伦特罗和沙丁胺醇的毛细管电泳-质谱联用分析[J].分析测试学报，2006，25（6）：43-45.

[13]HOWELLS L,SAUER M,SAYER R,et al.Extraction and clean up of the beta agonist salbutamol from liver and its determination by enzyme immunoassay[J].Anal Chim Acta,1993,275(1-2):275-278.

[14]杨正涛，张乃生，史利军，等.β-激动剂多组分残留的没脸免疫分析法[J].中国农学通报，2008，24（8）：23-24.

[15]王建平，沈建忠.猪肝和猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗残留的酶联免疫吸附检测法研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（4）：397-401.

[16]吴巧丽，叶春生.胶体金免疫层析技术快速检测沙丁胺醇残留[J].现代食品科技，2012，28（11）：1595-1599.

[17]张亚峰，张会彩，刘聚祥，等.沙丁胺醇胶体金免疫试纸条的研制[J].中国兽医杂志，2009，45（9）：59-60.

[18]王 森，周亚莲，盛慧萍，等.瘦肉精三合一胶体金快速检测板的研制及在畜肉中的应用[J].浙江农业科学，2012（12）：1715-1719.

[19]中国兽医药品监察所.农业部1025 号公告—18—2008，动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法[S].北京：中国标准出版社，2008.