微波辅助PEG提取金银花叶中绿原酸的工艺优化

黄 荣，向 福，2 *，马文静，吴 伟，项 俊，2

（1.黄冈师范学院生命科学学院，湖北 黄州 438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000；3.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435003）

金银花（Lonicerae japonicaThunb）又名忍冬，是我国一种传统的中草药植物。绿原酸是金银花中主要的活性成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血压、保肝利胆以及清除自由基等功能[1]，被誉为“植物黄金”，广泛用于食品、保健、医药、卫生和化工等领域。金银花叶中含有丰富的绿原酸，山东、河南等地金银花叶中的绿原酸含量均超过了同一时期的金银花[2]，而黄冈地标产品—罗田金银花，其叶中绿原酸含量达7%左右[3]。另外，金银花叶的产量是同期花产量的10倍左右[4]。因此，金银花叶中的绿原酸比金银花中的更丰富且采集更容易、成本更低廉，科学利用金银花资源，对促进大别山地区金银花产业的发展具有重要的应用价值和现实意义。

以金银花为原料提取绿原酸的工艺主要有醇提法、水提法、半仿生法等[5-8]。但这些提取方法存在耗时长、成本高、提取率低、有机溶剂消耗量大、杂质多等问题。研究一种成本低、产率高、简单快速、环境友好的绿原酸提取工艺对大别山金银花产业的发展意义重大。

微波法提取具有选择性好、穿透力强、溶剂用量少、提取时间短、提取效率高等优点[9-12]，且能有效克服中药材细粉煎煮提取过程中的堵塞、糊化等问题，适合工业化生产[13]。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有良好的生物相容性和低免疫原性，不易燃、耐酸碱、耐高温、成本低、溶解性好、可生物降解、环境友好、低分子质量的PEG（如PEG-200）不挥发等诸多优良性质，且美国食品药物管理局（food and drug administration，FDA）已证实其安全无毒[14]。因此，将PEG用于药用植物中活性成分的提取具有广阔的应用前景。

本研究以金银花叶为原料，采用微波辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸。以绿原酸的提取率为响应值，在单因素试验基础上对提取温度、PEG-200体积分数、提取时间等关键影响因素，根据Box-Behnken原理设计响应面优化试验，探讨微波辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸的优化工艺，对科学利用金银花资源、促进大别山地区金银花产业的发展具有重要的应用价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花叶：采于湖北楚天舒药业有限公司金银花基地，阴干，粉碎备用；绿原酸标准品（纯度≥98%），批号20120117：上海源叶生物科技有限公司；PEG-200（分析纯）：上海山浦化工有限公司。

1.2 仪器与设备

Varian Cary 100 Scan型紫外可见分光光度计：美国Varian公司；MM721NH1-PW型微波炉：广东美的微波电器制造有限公司；Ax-205 METTLER TOLEDO型电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅：北京西城区医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 绿原酸的提取分离

微波辅助PEG-200提取金银花叶中绿原酸提取液，通过大孔树脂吸附，乙醇溶液洗脱，浓缩干燥，可分离制得绿原酸提取物。

1.3.2 绿原酸标准曲线及提取率测定

精确称取10.8 mg绿原酸标准品置于100 mL容量瓶，用体积分数30%的PEG-200定容，摇匀即可得质量浓度为108 μg/mL的绿原酸参照液。取2 mL参照液于10 mL容量瓶，用体积分数30%的PEG-200定容至刻度，摇匀，以体积分数30%的PEG-200为空白，在波长200～800 nm范围扫描，确定检测波长为327 nm。

绿原酸标准曲线制备：吸取绿原酸参照液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL分别置于6个10 mL的容量瓶中，用体积分数30%的PEG-200定容，摇匀，以体积分数30%的PEG-200为空白，在波长327 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。

以绿原酸质量浓度（C）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，得标准曲线回归方程为A=0.056 4C+0.004 3，相关系数R2=0.999 8，绿原酸在10.8～54.0 μg/mL质量浓度范围内与吸光度值线性关系良好。

绿原酸提取率计算公式：

式中：Y为绿原酸提取率，%；V为绿原酸提取液体积，mL；m为金银花叶的质量，g；A为吸光度值；N为稀释倍数。

1.3.3 单因素试验

称取5份阴干、粉碎后的金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按照一定的料液比加入不同体积分数的PEG-200，在不同的微波功率条件下处理不同时间，然后在一定温度条件下回流一定时间提取金银花叶中绿原酸。通过单因素试验分别考察微波功率、微波时间、PEG-200体积分数、料液比、提取温度和提取时间等因素对金银花叶中绿原酸提取率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，选取提取温度（X1）、PEG-200体积分数（X2）、提取时间（X3）3个对金银花叶中绿原酸提取率影响较为显著的因素，以绿原酸提取率（Y）为响应值，利用Box-Behnken中心组合试验设计原理设计3因素3水平的响应面优化试验，响应面分析因素和水平如表1所示。

表1 绿原酸提取响应面分析因素及水平Table 1 Variables and levels of response surface design for chlorogenic acid extraction

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波功率对绿原酸提取率的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按料液比1∶20（g∶mL）加入体积分数30%的PEG-200，在70 W、210 W、350 W、490 W、630W功率条件下，微波处理60 s，然后80 ℃回流15 min提取金银花叶中绿原酸，考察微波功率对绿原酸提取率的影响。结果如图1所示。

图1 微波功率对绿原酸提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of chlorogenic acid

由图1可知，微波功率为70～350 W时，随着微波功率的增加，绿原酸提取率增大；在微波功率达到350 W时，绿原酸提取率达到峰值，为4.93%；继续增大微波功率（＞350 W），绿原酸提取率则急剧降低。这是因为分子运动速度随着微波功率增加而加快，绿原酸的提取率增加；但微波功率太高，所产生的高温不仅导致绿原酸分解，还会导致蛋白质凝固，绿原酸难以溶出细胞壁[15]。因此，选择微波功率350 W为宜。

2.1.2 微波时间对绿原酸提取率的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按料液比1∶20（g∶mL）加入体积分数30%的PEG-200，在350 W功率下，微波处理50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，然后80 ℃回流15 min提取金银花叶中绿原酸，考察微波时间对绿原酸提取率的影响。结果如图2所示。

图2 微波时间对绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of microwave time on the extraction rate of chlorogenic acid

由图2可知，在试验条件内，绿原酸提取率呈波浪形变化，当微波时间为70 s时，金银花叶中绿原酸的提取率最高，为5.43%。微波辐射一定时间内对金银花叶细胞破碎作用较大，使细胞内的有效成分快速溶出[15-16]，绿原酸提取率达到最高，但超过70 s后，微波产生的强热效应导致绿原酸结构破坏，提取率降低。因此，选择微波时间70 s为宜。

2.1.3 PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按料液比1∶20（g∶mL）分别加入体积分数10%、20%、30%、40%、50%的PEG-200，在350 W功率下，微波处理70 s，80 ℃回流15 min提取金银花叶中绿原酸，考察PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响。结果如图3所示。

由图3可知，PEG-200体积分数为10%～30%时，随着PEG-200体积分数的增加，绿原酸提取率逐渐增加；在PEG-200体积分数为30%时，绿原酸提取率达到峰值，为5.37%，提取效果最好；PEG-200体积分数＞30%以后，绿原酸提取率有所下降。原因可能是PEG能增加了绿原酸的溶解度，同时也改变了溶液的耗散因素和微波能量传递[14]，从而加快能量传递速度和提取效率，导致绿原酸提取率随着PEG-200体积分数的增加而增加，但PEG-200体积分数的增大会增加溶液的黏度，从而影响传质，绿原酸提取率降低。因此，选择PEG-200体积分数30%为宜。

图3 PEG-200体积分数对绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of PEG-200 concentration on the extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比对绿原酸提取率的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，分别按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）加入体积分数30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，80 ℃回流15 min提取金银花叶中绿原酸，考察料液比对绿原酸提取率的影响。结果如图4所示。

图4 料液比对绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of the solid liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

由图4可知，随料液比的增加，绿原酸提取率先不断上升，后趋于平缓，当料液比为1∶20（g∶mL）时绿原酸得提取达最高，为5.24%；料液比＞1∶20（g∶mL）后绿原酸提取率趋于稳定。考虑绿原酸提取后的去除提取溶剂的经济成本，因此，选择料液比1∶20（g∶mL）为宜。

2.1.5 提取温度对绿原酸提取的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按液料体积质量比1∶20（g∶mL）加入体积分数30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，分别在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃条件下回流15 min提取金银花叶中绿原酸，考察提取温度对绿原酸提取率的影响。结果如图5所示。

由图5可知，在70～85 ℃时，随着提取温度的增长，绿原酸的提取率不断上升，在85 ℃时提取率达到最大值，为5.33%。提取温度＞85 ℃，绿原酸提取率逐渐下降。随着提取温度的升高，绿原酸提取率增加，但提取温度太高会导致绿原酸分解。因此，选择85 ℃回流的提取温度为宜。

图5 提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

2.1.6 提取时间对绿原酸提取率的影响

称取5份金银花叶粉末5 g置于圆底烧瓶，按液料体积质量比1∶20（g∶mL）加入体积分数30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，在85 ℃分别回流5 min、15 min、25 min、35 min、45 min，提取金银花叶中绿原酸，考察提取时间对绿原酸提取率的影响，结果如图6所示。

图6 提取时间对绿原酸提取率的影响Fig.6 Effect of extraction time on the extraction rate of chlorogenic acid

由图6可知，在5～25 min时，随着提取时间的延长，绿原酸的提取率不断上升，在25 min时绿原酸提取率达到最大值，为5.88%。提取时间＞25 min之后绿原酸提取率开始下降。这是由于在85 ℃温度下，提取时间过长会导致绿原酸的分解所致。因此，提取时间以25 min为宜。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，固定微波功率、时间及料液比分别为350 W、70 s和1∶20（g∶mL），采用Box-Behnken中心组合试验设计，以提取温度（X1）、PEG-200体积分数（X2）和提取时间（X3）为自变量，以绿原酸提取率（Y）为响应值，对金银花叶中绿原酸提取工艺进行优化，响应面试验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表2试验数据利用Design Expert 8.0.5b软件进行多元回归拟合，得到绿原酸提取率（Y）对提取温度（X1）、PEG-200体积分数（X2）和提取时间（X3）的二次多项回归模型方程如下：

由表3方差分析可知，各因子F值反映了对响应值的重要性，F值越大，则P值越小，该因素对响应值作用越大。F（X2）=848.28＞F（X3）=9.17＞F（X1）=0.017，表明各因子对绿原酸提取率影响程度大小为：PEG-200体积分数＞提取时间＞提取温度。就显著性而言，X2、X22对响应值Y有极显著影响（P＜0.000 1），X3、X1X2、和X32等因素对响应值Y有显著影响（P＜0.05）。因此，尽管提取温度、提取时间、PEG-200体积分数等3个因素的交互作用对绿原酸的绿的影响较小，但各因素与响应值Y之间不存在简单的线性关系，绿原酸提取率同时也受到二次项的影响。模型分析结果表明，模型的P＜0.000 1，表明模型极其显著；失拟项P值为0.623 2＞0.05，即模型失拟项不显著，表明模型对试验数据拟合度较好，试验误差小；变异系数较小，为0.57%，表明操作可信；模型信噪比值很高，为32.498，远＞4，表明模型可信度高，有意义，可用于预测，且预测拟合度0.961 8和校正拟合度0.988 7比较一致，说明该模型较为合适。相关系数R2=0.996 0表明回归方程中99.60%的因变量变化可以由其自变量的变化进行解释，也就是说在该工艺中，未计入回归方程的变量对金银花叶中绿原酸的提取效果影响较小。因此，可用该模型代替真实试验点对金银花叶中绿原酸提取过程进行分析和预测。

由多元拟合模型产生的响应面及其等高线，结果见图7。表示用于响应面分析的提取温度、提取时间、PEG-200体积分数等3个因素中，某个因子为零水平时，另外两个因子对绿原酸提取率的影响，直观地反映各因子及其相互间的交互作用。由图7可知，提取时间和PEG-200体积分数间不存在交互作用，表现为等高线中心区域呈明显圆形；提取时间和提取温度间的交互作用明显，表现为等高线中心区域呈明显的椭圆形；提取温度和PEG-200体积分数间的交互作用不明显，表现为等高线中心区域不构成椭圆。此外，响应面均为开口向下的凸面，提取温度、提取时间、PEG-200体积分数等3个因素与绿原酸提取率基本呈抛物线关系，说明在试验区域内存在最佳值。多元回归模型预测的最佳提取工艺条件为温度81.53 ℃，PEG-200体积分数41.50%，提取时间23.58 min，该条件下绿原酸提取率预测值为5.86%。

图7 提取温度、PEG-200体积分数和提取时间交互作用对绿原酸提取率的响应面及等高线Fig.7 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between extraction temperature,PEG-200 concentration and extraction time on extraction rate of chlorogenic acid

2.3 响应面验证试验

验证时考虑实际操作问题，将最佳条件修正为：微波功率350 W，微波时间70 s，料液比1∶20（g∶mL），提取温度82 ℃，PEG-200体积分数40%，提取时间24 min。在修正后的最佳条件下，利用微波辅助PEG从金银花叶中提取绿原酸，进行了5次平行验证试验，绿原酸实测平均提取率为5.87%，相对误差为0.17%，与理论预测值5.86%吻合度较高，说明响应面优化回归模型对实际工艺操作具有一定的指导意义。

3 结论

本研究采用单因素试验和响应面试验对金银花叶中绿原酸提取条件进行了优化，建立了微波辅助PEG提取金银花叶中绿原酸的最佳工艺为微波功率350 W，微波时间70 s，料液比1∶20（g∶mL），提取温度82 ℃，PEG-200体积分数40%，提取时间24 min。在最佳条件下绿原酸提取率为5.87%。该工艺简单可行、快速有效、绿色环保，适合于提取金银花叶中绿原酸工业化生产。

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