发酵剂用量对硬质蒙古干酪风味变化的影响

高 鑫，张 亮，李 博

（1.上海工会管理职业学院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大学医学院，上海 200240）

干酪是乳经适当的乳酸发酵后凝乳并分离出乳清后的乳制品，其组织结构好，营养价值高[1]。近年来，干酪产量一直保持着上升趋势，2011年世界干酪产量已经超过2 000万t。受居民饮食习惯、对奶酪的认知情况和消费能力等影响，我国干酪的发展正处于市场培育阶段[2-3]。有学者建议，中国应借鉴日本和韩国的经验，对传统干酪进行配方和工艺优化，制造适合中国人的干酪食品，如蒙古族干酪，藏族、维吾尔族的奶疙瘩，白族的乳扇等[4]。长期以来，这些传统干酪基本上是家庭作坊式生产，没有形成规模以及培育稳定的消费群体，对我国干酪市场发展的影响有限。因此，如何加大干酪产品的生产和市场引导的力度，引导消费，研制适合于国人消费的干酪加工技术迫在眉睫[5]。本试验探讨了一种硬质蒙古干酪制作过程中发酵剂的使用量对干酪风味变化和微生物多样性的影响，为进一步研制和开发该干酪提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳、乳清粉、奶油：光明乳业股份有限公司；干酪发酵剂（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）：北京川秀国际：丹麦丹尼斯克（中国）有限公司；美国材料与试验协会D2887-01 N-烷烃标准样品：美国Restek公司。

平板计数琼脂培养基（plate count agar，PCA）：蛋白胨贸易有限公司；凝乳酶10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1 000 mL。

大肠杆菌培养基：胰蛋白胨20 g，3号胆盐1.5 g，乳糖5 g，K2HPO44 g，KH2PO41.5 g，NaCl 5 g。

金黄色葡萄球菌培养基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 100 g，K2HPO42.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠10 g。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉8 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，柠檬酸三氨2 g，乙酸钠·3H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，吐温-80 1 g。

改良MC培养基：大豆蛋白胨5 g，牛肉膏粉3 g，酵母膏粉3 g，葡萄糖20 g，乳糖20 g，CaCO310 g，琼脂15 g，中性红0.05 g。

1.2 仪器与设备

VARIOKLAV高压蒸汽灭菌锅：美国赛默飞世尔科技公司；FE20pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；HPH2000/4-DH5高速剪切均质机：美国IKA公司；MCO-15AC生化培养箱：日本三洋机电有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS固相萃取探针：美国Supelco公司；DB-5MS色谱柱：百灵威科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硬质蒙古干酪的制作

原料乳标准化后进行巴氏杀菌处理，将杀菌后的原料乳温度降至30 ℃，采用直投式加入发酵剂冻干粉，加入量为0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L原料乳。发酵剂通过发酵产酸，当原料乳的pH值降低0.1～0.2时，加入凝乳酶（3 g/100 L原料乳，1%的灭菌食盐水溶解）凝乳40 min，用干酪切刀切割凝块大小为1 cm左右，采用自然排乳清法将乳清排出，排除后在凝乳粒中加盐，加盐量为30 g/kg凝块。加盐后的干酪进行装模（100 mm×100 mm×50 mm），然后放在压模机上以10 g/cm2压力压20 min，50 g/cm2压2 h后翻转，100 g/cm2压16 h。然后切成大小10 cm×5 cm×5 cm的小块，放在自封袋中，密封后在8 ℃、相对湿度（relative humidity，RH）85%条件下成熟，此时为0 d。根据发酵剂使用量的不同，记为硬质蒙古干酪A（0.5 g/L）、干酪B（1.0 g/L）和干酪C（1.5 g/L）。每隔60 d（含0 d）取样一次。

1.3.2 成熟过程中风味变化

根据李博等[6]对干酪风味研究的方法，准确称取5.00 g干酪样品放在20mL顶空进样瓶内，加入5 mL 25%NaH2PO4，盖好盖子，在50 ℃的超声波水浴中平衡30 min，使干酪中的风味化合物充分进入顶空进样瓶的顶空内。将已经老化好的固相萃取头插入到顶空进样瓶的顶空内进行萃取，吸附30 min后，拔出萃取头，将吸附了分析组分的萃取头插入到气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进样器内在250 ℃条件下进行解吸，解析后用GC-MS仪器进行分析。

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）的条件：

设备：CTC三位一体自动进样器；萃取头：50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS；温度：120 ℃；时间：加热25min，萃取15min；振荡速度：加热250 r/min，萃取250 r/min；解吸时间：3 min。

色谱分析条件：

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温：40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；进样温度：250 ℃；控制模式：恒流，1.0 mL/min；接口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：50 ℃；电离方式：电子电离（electron ionization，EI），70 eV；扫描方式：全扫描，20～400 m/z，溶剂延迟3.5 min。

得到完整、数据全面的总离子流色谱图后进行数据分析，通过工作站数据分析软件和NIST 2011质谱库提供的标准质谱图对照，通过面积归一化得到每种化合物的峰面积。

1.3.3 成熟过程中微生物多样性变化（培养基方法）

依照GB 4789.18—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验—乳与乳制品检验》进行[7]。

2 结果与分析

2.1 干酪风味变化

利用SPME-GC-MS分析方法对成熟过程中的干酪A、B、C进行挥发性风味化合物的检测，结果见表1。

由表1可以看出，干酪A在0 d时，共检测出28种化合物，其中酯类化合物10种，酸类化合物7种，醇类化合物6种，酮类化合物1种，醛类化合物1种，其他类化合物3种。在含量方面，醇类化合物占到70.76%，酯类化合物次之，占到23.48%。随着干酪的成熟，挥发性风味化合物的种类逐渐增多，到第180天时，共检出31种化合物，其中酯类化合物由10种增加至15种，含量增加至44.79%。其中，癸酸甲酯由0 d时的19.94%增加至49.36%（120 d），后降低至38.76%（180 d）。而醇类化合物在180 d时下降至42.05%，大部分用于酯类化合物的产生。因此，在干酪A的成熟过程的挥发性风味化合物中，醇类和酯类一直是主要的风味物质。检测中所得酯类物质中癸酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯含量较高，形成了果味特征，给干酪以淡淡的果味气息。醇类物质中主要是乙醇和异戊醇，表现出温和的花香味。值得注意的是，干酪中很多代谢途径都与乙醇的合成有关，如乳糖代谢途径通过磷酸戊糖途径产生乙醇等，在干酪成熟后期乙醇参与乙酯类化合物的形成，造成其含量大幅下降，由0 d时的55.66%下降至180 d时的15.80%。酸类物质以乙酸、辛酸和癸酸为主，主要贡献了干酪风味中的醋味、辛辣味、酸败味以及部分奶香味。醛、酮类物质分离检测出的很少，这是由于它们在干酪成熟过程中属于过渡态化合物，不会在干酪中进行显著积累，可以迅速被还原生成伯醇或者被氧化生成相应的酸，所以在干酪成熟过程中分离得到的醛、酮类物质很少[8]。

干酪B在0 d时，共检测出28种化合物，其中酯类化合物11种，酸类化合物7种，醇类化合物6种，酮类化合物1种，醛类化合物1种，其他类化合物2种。在含量方面，醇类化合物占72.76%，酯类化合物次之，占19.52%。随着干酪的成熟，挥发性风味化合物的种类逐渐增多，到第180天时，共检出33种化合物，其中酯类化合物由12种增加至15种，含量增加至47.15%，醇类化合物下降至34.06%。干酪B中的醇类物质和干酪A基本一致，由于干酪B使用的发酵剂量多，所以在0 d时产生的乙醇量要高于干酪A，但与干酪C差别不大。在成熟过程中，干酪B和C中乙醇的消耗量也大于干酪A，使得乙醇含量下降较快。酯类化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，它们的风味特征为果味、奶油味等，

其他酯类化合物表现不明显，含量较低。酸类化合物中以癸酸、辛酸和乙酸为主，酸的含量都高于A组，主要贡献了干酪风味中的腐臭味、酸味、奶香味等。醛、酮类化合物分离检测出的也很少。干酪B成熟过程中风味化合物种类多于干酪A，组分更为丰富。但是，干酪B中各风味化合物含量略低于干酪A，较高的发酵剂使用量可以加快挥发性风味化合物产生速度，造成中间产物的减少，终产物的增加。因此，干酪B风味更加均匀适中，可以形成更好的风味感官。

表1 干酪成熟过程中挥发性风味化合物的相对含量变化Table 1 Relative content changes of volatile compounds from the Mongolian cheese during ripening %

干酪C在0 d时，共检测出32种化合物，其中酯类化合物14种，酸类化合物7种，醇类化合物6种，酮类化合物1种，醛类化合物1种，其他类化合物3种。在含量方面，醇类化合物占71.39%，酯类化合物次之，占19.23%。到第60天时，酯类化合物增加至15种，含量增加至46.01%，醇类化合物下降至32.47%。干酪C中的醇类、酯类化合物与干酪A、B基本一致。酯类化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，醇类化合物主要是乙醇和异戊醇。酸类化合物中以癸酸、辛酸和乙酸为主，由0 d时的9.11%增加至19.82%，远大于干酪A和B，使得奶酪明显产生了酸味为主的风味构成，明显表现出酸味，影响了干酪的口感。

在硬质蒙古干酪的挥发性风味化合物中，以酸、酯、醇三类化合物为主。酯类是硬质蒙古干酪中最重要的芳香物质，其香味阈值普遍较低（平均值为0.1 mg/kg）。除癸酸甲酯外，乙酯类化合物是最重要的一类，表现出明显的水果香味[9]，如乙酸乙酯可以提供甜味、果香味；己酸乙酯则可以提供果香味和腊味；癸酸乙酯既有果香味还具有明显的椰子香味等[10]。醇类物质在硬质蒙古干酪也具有较高的产生量，一是乳糖代谢途径产生；二是脂肪酶对干酪中的脂肪酸进行降解所产生[11]。一般来讲，醇类物质阈值较高，在干酪风味中的贡献较小，但是醇类可以和酸类物质进一步反应生成酯类，可以间接对干酪风味产生影响[12]。醇类物质在干酪中起到的作用主要是提供植物香味及酸败味等。酸类也是硬质蒙古干酪的重要风味物质之一，主要有甘油三酯水解为脂肪酸或者是代谢过程中产生的中间代谢产物。短链脂肪酸对于形成干酪的风味结构具有重要的作用，如辛酸则可能带来腊味、皂味、酸败味及果味；癸酸则贡献酸败味[13]。一些长链的烷烃和干酪中存在的某些细菌有关，其总量较少，同时烃类化合物的芳香风味阈值较高，其本身不具有风味，对干酪的风味影响可以忽略不计[14]。

2.2 微生物多样性变化

在硬质蒙古干酪成熟过程中，检测到的微生物除了肠杆菌外，其余微生物都随时间而增长。从表2可以看出，对于嗜温好氧菌（total mesophilic aerobic bacteria，TMAB）来讲，干酪A、B、C三者都是呈现增长趋势。

表2 硬质蒙古干酪在成熟过程中的微生物数目变化Table 2 Microbial counts change of Mongolian cheese during ripening lgCFU/g

在干酪制作过程中，使用的发酵剂为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，所以乳酸菌是干酪成熟过程中的优势菌，在干酪成熟早期，在培养基上，两种乳酸菌数目相差较小，成熟过程中呈现快速增加。但到中后期，嗜热链球菌生长速度趋缓，保加利亚乳杆菌生长速度相对加快。嗜热链球菌的生长与干酪中的盐分有关，高盐分会抑制嗜热链球菌的生长速度[15]。保加利亚乳杆菌耐受力相对较好，能够迅速适应不良环境，占据优势[16]。这两种乳酸菌在干酪成熟过程中的作用非常重要，可以产生小肽、游离氨基酸和游离脂肪酸，直接影响干酪风味或者是作为风味化合物的前体间接影响干酪风味[17]。对肠杆菌的计数是判断产品是否处于良好卫生状况的重要指标之一。如果干酪中肠杆菌的数目较高，说明在干酪生产中的卫生情况较差[14]。在干酪成熟初期，干酪A、B、C都有肠杆菌的检出，不到1个数量级，可能是和干酪加盐的过程有关。葡萄球菌和沙门氏菌在干酪成熟过程中一直没有检出，也没有发现干酪成熟时变质的表象。

3 结论

通过SPME-GC-MS方法对硬质蒙古干酪中的挥发性风味化合物进行了分离检测，在不同成熟期内各化合物呈现动态变化。发酵剂使用量对干酪风味会产生影响，当使用量为1.5 g/L原料乳时，酸类化合物会大量产生，导致干酪酸味较重。而使用量为1.0 g/L原料乳时，其成熟过程中风味化合物种类多于使用量为0.5 g/L原料乳，组分更为丰富，风味更加均匀适中，可以形成更好的风味。

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[7]GB 4789.18—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验—乳与乳制品检验.

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