可食悬浮式魔芋载体培养虫草的研究

罗宇霞，康德灿*，陈彩霞，刘 玉，肖亚琪

（西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一种极其珍贵的食、药用真菌，富含虫草多糖、虫草酸、虫草素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、生物碱、各种维生素和20多种矿质元素，具有抑菌、降血糖、抗疲劳、抗肿瘤、提高免疫力等很多药用功效[1-3]。魔芋（Amorphophallus konjac）的主要成分为葡甘聚糖（konjak glucomannan，KGM），是理想的膳食纤维，不含热量，有饱腹感，具有减肥、改善肠道环境、抗氧化等功能[4]。葡甘聚糖还具有持水增稠、悬浮、胶凝、黏接、成膜等多种独特的理化性质而使其具有广泛的应用和开发价值，由魔芋葡甘聚糖、海藻酸钠和其他润滑剂、增塑剂等制备的膜材料，可用于控制药物的释放[5-6]。天然的冬虫夏草十分稀少，难以满足保健和用药的要求，所以虫草真菌人工培养显得尤为必要。作为魔芋提取物羧甲基魔芋胶的氯乙酸醚化改性产物，已被作为载体材料用于纳米粒给药系统的制备[7]。

1932 年，小林义雄等[8]首次在米饭培养基上成功获得蛹虫草子座，拉开了米饭培养基栽培蛹虫草的序幕。张显科等[9-12]研究学者，先后以大米、小米、玉米、小麦等培养基培养出蛹虫草子座。人工培养虫草主要采取人工栽培和液体培养两种方法[13]，在人工栽培时，根据栽培容器，可分为瓶栽、袋栽及盒栽3种，近几年来发展运用最多的是盆栽法[14-15]，但固体栽培具有培养周期长、环境条件不易控制、培养基无法给虫草菌注入新营养的缺陷；而液体发酵培养虫草又具有污染率高，子实体产量低而不稳，风险大等缺点；导致人工培养虫草仍未建立完善的生产模式。

本试验将魔芋精粉经过加水热溶、加碱改性制成凝胶，经高压、高温、膨化处理，在低温冷冻条件下制成可食悬浮式改性载体。将魔芋载体漂浮于液体培养基上层，在魔芋载体上接种虫草菌，随着其菌丝体生长，魔芋载体均匀吸收液体培养基营养，不断地向虫草菌提供液体中的营养和魔芋本体中的营养。采用改性魔芋载体培养虫草能在较短时间生产出虫草菌丝体，出草成熟后将载体及菌丝体同时收获，可获得兼具虫草、魔芋两者药用价值的复合功能型保健材料，极具有开发潜力。本研究为中小保健食品企业开创了一种新型的试验模型。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

大邑虫草菌种（Cordyceps dayigensis，CD）、广东虫草菌（Cordyceps guangdongensis，CG）、四川虫草菌株（Cordyceps sichuangensis，CS）：华能生物科技公司。

1.1.2 主要试剂

魔芋精粉（食品级）：四川省农副产品加工技术开发公司成都分公司；食用蔗糖、麦麸、蚕蛹粉：市售；酵母膏：上海乾劲化工科技有限公司；VB1（分析纯）：威清南波湾生物技术有限公司；蛋白胨：上海乾劲化工科技有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁均为分析纯：南京化学试剂股份有限公司；聚氨酯海绵：苏州市天启聚氨脂制品有限公司。

1.1.3 培养基

固体斜面培养基：麦麸20 g、硫酸镁0.5 g、蔗糖20 g、磷酸二氢钾1.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、蚕蛹粉1 g、VB14g，蚕蛹粉1 g，再加入琼脂粉15 g煮沸，加水定容至1 000 mL，调pH 7.2，分装18×180 mm试管，120 ℃、0.1 MPa灭菌30 min，放置成斜面冷凝备用。

液体培养基：麦麸20 g、蔗糖20 g、磷酸二氢钾1.5 g、硫酸镁0.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、VB14 g。加水定容至1 000 mL，调pH 6.0～6.5，分装于200 mL三角瓶，120 ℃、0.1 MPa灭菌30 min，备用。

1.2 仪器与设备

JY-1002型电子天平：上海上天精密仪器有限公司；YM100Z智能型立式压力蒸汽灭菌器：上海嘉措仪器设备有限公司；DHP-9012A电热恒温培养箱：上海飞越实验仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；BZF-30真空干燥箱：上海科晓科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 虫草菌种的活化

将虫草菌种接种于固体斜面培养基上，置24 ℃下恒温黑暗培养7～10 d，让斜面长满菌丝。观察可见菌丝生长浓密旺盛，先呈白色绒毛状，随后变成浅桔黄色。

1.3.2 可食悬浮式改性魔芋载体的制备

在高温（100 ℃）、强碱（pH 12）条件下，魔芋精粉与水比例为1∶35（g∶mL）制作凝胶过程中，葡甘聚糖支链上的乙酰基脱离，分子间联结成立体网状结构，网眼间保持着不能自由流动的水分，使该物系成具弹性的半固体状[16-18]，充分体现了葡甘聚糖的赋形性及持水保水性，形成的凝胶经高压、高温不能再恢复到流体状态，由于这种热不可逆性，可以作为虫草液体悬浮培养的载体。在脱乙酰反应发生的同时向其中加入碳酸氢钠（食品级），能使这种葡甘聚糖体内布满细小均匀的孔径，将改性制成后的凝胶经过超低温冷冻、脱水，干燥后形成海绵状的载体，能平稳漂浮在液体表面，均匀绵延吸收液体中的养分。

（1）魔芋载体制作工艺流程

魔芋精粉→加水→煮沸→加入碳酸钠→加入碳酸氢钠→高速搅拌→倒入固形容器→冷凝成型→清水漂洗→沸水焯煮→老化蒸煮→凝胶速冻→解冻→烘干→多孔载体

（2）操作要点：

a.魔芋凝胶初制

当水温升至50～70 ℃后，取不同魔芋载体配方加入300 mL蒸馏水中，加热搅动，使之逐渐熟化，与水融为一体。煮沸约30 min魔芋葡甘聚糖充分熟化溶胀后，及时加入碳酸钠，促使容器内物料加速熟化溶胀，化清，凝固。快速加入碳酸氢钠，在加入碳酸氢钠瞬间后，10～15 s内，要快速﹑高速搅拌流质浓料，尽可能多的将空气搅进物料，以形成气泡从而增加载体孔径，使载体能够很好悬浮。然后要迅速将流质浓料倒入固形容器内，等待物料在室温下自然冷却凝固。

用木筷垂直插入检查凝胶是否已完全成型。如木筷插入后垂立不倒，拔出后留孔不闭合，筷子上不粘胶状物，说明凝胶已全部成型。用清水漂除余碱。用沸水焯煮除去余碱，再用冷水漂洗，反复2～3次得到多孔魔芋凝胶。

b.魔芋凝胶的老化

先将固定容器内的魔芋糕用80 ℃左右的水温，蒸煮10～12 min，使产品的韧性和强度增加，含碱量均匀适度。

参考李娟的实验方法，采用Mixolab混合实验仪对空白和加酶全麦粉的热机械学特性参数进行测定。实验条件选用 Chopin+标准。试验前，首先需对待测粉样的水分含量进行测定。整个测试过程获得的参数（C1、C2、C3、C4、C5、α、β、γ）释义见文献[12]。

c.魔芋凝胶的固形

将老化后形状规则的制品从容器中取出，在沸水中煮5～10 min，形成固定的形状。

d.魔芋凝胶的冷冻

魔芋凝胶速冻后冰晶粒的增大，使魔芋凝胶变为海棉状泡沫气溶胶。冷冻是悬浮载体制作的关键工序，分3个阶段进行。

第一阶段：将固形后的制品，采用冷风、冷水以及自然降温的方法，使其温度逐渐降低到常温以下。

第二阶段：将冷却过的制品，及时迅速转入冰箱冷藏室，用5 ℃左右的温度，经15～30 h，进行预冻处理。

第三阶段：将预冻制品迅速转人冷冻室，用-18～-20 ℃的温度，冷冻至少48～72 h。

e.魔芋凝胶的烘干

将冷冻后的魔芋凝胶烘干，烘干后按照广口玻璃瓶的大小剪成圆形，逐个称重、标记、记录，使用聚氨酯海绵作为对照。在0.1 MPa、121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min。将高压灭菌后的魔芋载体和聚氨酯海绵载体用干燥箱在60 ℃烘干，置真空干燥器中干燥至质量恒定，备用。

1.3.3 魔芋载体综合评价

选取6名研究人员组成评定小组，进行综合评分。评分依据有孔径、浮力、吸水性、柔韧性、成形效果5个方面，按照权重进行综合评分，孔径和浮力各占30%，吸水性占20%、柔韧性，成形效果各占10%，满分为10分。具体评分标准见表1。

表1 魔芋载体的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of Amorphophalms konjac carrier

1.3.4 魔芋载体配方正交优化试验

查阅大量文献，在前期单因素试验的基础上，筛选魔芋精粉、米粉、碳酸钠和碳酸氢钠最佳配方，以魔芋载体综合评分为评价指标，采用4因素3水平的正交试验设计，因素与水平见表2。

表2 载体配方优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for carrier formula optimization

1.3.5 接种与培养

由于魔芋载体和聚氨酯海绵载体都具有孔径细密、液体吸收力强、浮力好等相似的结构和性状，本试验采用聚氨酯海绵载体作为魔芋载体的对照。在超净工作台内将魔芋载体和聚氨酯海绵载体放入编号的广口瓶液体培养基中，液体培养基深约2 cm。将长满虫草菌丝的斜面培养基分割成1 cm2见方的小块，然后分别挑入广口瓶，置于魔芋载体及海绵载体上。每瓶呈对角线均等放置4块。接种CS（四川虫草菌株）、CD（大邑虫草）、CG（广东虫草）菌种，每种虫草做3个平行，一个对照。

接种完毕后，将已接种的广口瓶放入恒温培养箱中24 ℃黑暗培养7 d左右，使菌丝体布满载体表面，放入培养箱的前3 d要求每天观察一次，及时清除污染瓶。待菌丝长满载体表面后，施以200 lx强度的光照，持续培养7～10 d，使菌丝体由白色逐渐转变为桔黄色，此时应延长光照时间，促使菌丝体转色、刺激原基形成。虫草原基形成后继续培养10 d左右，原基开始分化成子座。

1.3.6 子实体的采收

接种培养两个月后可见子实体长成上粗下细的棒状，顶端出现小的突起，且表面出现粒状粉末时，这表明子实体成熟[19]。子实体成熟后，小心将子实体和载体一起采收。滤去培养液后，放入干净的培养皿中，置于真空干燥箱内在50 ℃下烘干至恒质量，采用重量法测定其生物量，记录数据。生物量计算公式如下：

虫草干质量=载体与子实体烘干物干质量－载体干质量

2 结果与分析

2.1 魔芋载体配方优化正交试验结果

在单因素试验基础上，选择魔芋精粉（A）、米粉（B）、碳酸钠（C）和碳酸氢钠（D）为试验影响因素，以魔芋载体综合评分为评价指标，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3 载体配方优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for carrier formula optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3通过极差R分析可得，各因素对魔芋载体效果影响的主次顺序为D＞A＞C＞B，即碳酸氢钠含量＞魔芋精粉含量＞碳酸钠含量＞米粉含量。制作悬浮式魔芋载体的最佳配方组合为A2B2C3D3，即魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸钠0.5%、碳酸氢钠0.5%。在此最佳载体配方条件下进行验证试验，载体综合评价为9.6分。此配方制作的载体浮力很好，能平稳的漂浮在水面上；质地软硬强度适中；柔韧性好不易变形；载体内有均匀的细小海绵状孔径且孔隙大小均衡；经过干燥后吸水效果好能绵延吸收水溶性营养。

由表4可知，A、B、D因素对综合评分的作用影响显著，C因素对综合评分的作用影响不显著。因此在筛选魔芋载体配方时要注意调节碳酸氢钠、魔芋精粉以及米粉的含量。

2.2 生物量测定及分析

待虫草子实体长成上粗下细的棒状，顶端出现小的突起，且表面出现粒状粉末时表明子实体已经成熟，小心将虫草子实体和载体一起采收。滤去培养液后，放入干净的培养皿中，在50 ℃条件下置于真空干燥箱内烘干至恒质量，计算其生物量，结果见表5，两种载体虫草生物量比较结果见图1。

表5 虫草生物量测定结果Table 5 Determination results of Ophiocordyceps sinensis biomass

图1 虫草干物质量的测定结果Fig.1 Determination results of dry Ophiocordyceps sinensis biomass

图1结果表明，在3个虫草品种中，海绵载体与魔芋载体的虫草干质量呈现极显著（P＜0.01）的差异，魔芋载体的四川虫草与广东虫草之间差异不显著（P＞0.05），而大邑虫草与四川虫草和广东虫草之间差异显著（P＜0.05）。这说明使用魔芋载体培养虫草的生物量明显高于海绵载体，魔芋载体更适合培养虫草。

3 结论

天然的冬虫夏草十分稀缺，难以满足食用和药用需求，人工栽培显得尤为重要。本试验利用正交试验优化了悬浮式魔芋载体的制作配方。结果表明，影响魔芋载体性能的主要因素是碳酸氢钠含量和魔芋精粉含量，其次是碳酸钠含量，影响最小的是米粉含量。制作魔芋载体的最佳配方为魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸钠0.5%、碳酸氢钠0.5%。试验所设计的改性魔芋葡甘聚糖载体悬浮性和内在孔径等性能都相当好，能悬浮在液体培养基表面，不必再采用机械支架支撑，实现真正的载体悬浮培养，达到了试验目的。

通过与海绵载体的对比，结果显示，悬浮式魔芋载体培养的虫草菌生物量明显高于海绵载体，且与传统的人工栽培虫草相比，具有生产周期短、设备简单、投入成本低、见效快、绿色天然等优点。本试验为产业化生产虫草药疗保健品，开发中国的药食资源，探索了一条可行途径。但如何保持虫草的优良遗传性状，将模型扩大成塑料盒式栽培，采用工业化的生产模式扩大悬浮式载体，进一步增加虫草菌体的产量，还有待进一步探索。

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