冷冻面团中酵母抗冻保护剂的优选

叶 鹏，王学东 *，宋劲松，陈聪莉，王玉东，彭思源，陈 挚

（1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉市仟吉食品有限公司，湖北 武汉 430023）

冷冻面团是20世纪50年代发展起来的一种面制品加工新技术，它利用抗冻能力强的面包酵母进行发酵，工艺上把面团制作和产品的烘烤或蒸制两个环节分开，非常适合连锁店的经营，它不仅扩大了面制品厂的生产规模，为连锁店节约了场地、设备、人力和时间，降低了产品的成本，方便了消费者能随时吃到新鲜的面包等发酵类面食[1-2]。低温速冻和冷藏过程会对面筋结构和酵母产生较大损伤，使得冷冻面团制成品常常伴有体积小、口感不好、结构粗糙等缺陷[3]。一方面，可以通过改进工艺条件和添加改良剂来改善面团品质特性，如乳化剂、氧化剂、酶制剂、胶体和磷酸盐类等[4-6]；另一方面，通过基因工程[7]、辐照诱变和杂交[8]等生物学方法选择耐冻酵母或添加酵母抗冻保护剂来减少酵母损伤，提高产品品质。国内外已有不少学者进行了大量的抗冻酵母筛选工作。但是，获得的耐冷冻酵母制作出的面包风味和口感与普通酵母制得的产品相比都比较差，且基因工程菌在食品领域仍存在较大争议。

陈丽君等[9]发现面包酵母胞内海藻糖与其耐盐性、耐冻性等耐受性存在一定的相关性，海藻糖含量越高，酵母耐性越好。SASANO Y等[10]探究发现筛选出能同时累积海藻糖和脯氨酸的耐冻酵母，其发酵力高于单独累积海藻糖或脯氨酸。其他的抗冻保护剂还包括小分子糖类[11]、甘油[12]和部分带电氨基酸[13-14]等，试验选取的几种抗冻保护剂成本低、安全性高、且部分还有营养强化的功效，故可外源添加抗冻保护剂保护冷冻面团中的酵母。该研究通过单因素试验、旋转正交组合设计[15]优选酵母抗冻保护剂，确定最佳的保护剂组合，为酵母的耐冻性研究提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高筋小麦粉：武汉仟吉食品有限公司（水分13.3%，粗蛋白11.9%，湿面筋35.6%）；高糖干酵母：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、浓硫酸、NaCl均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖：北京奥博星生物技术有限公司；海藻糖、甘油、L-脯氨酸、白砂糖均为食品级：深圳恒生生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母提取物1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、琼脂糖2%，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

BS22422分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DW-40L188医用低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；JB1-5F型急速冷冻柜：上海金城制冷设备有限公司；XH-C漩涡混合仪：金坛市精达仪器制造有限公司；LRHS-150-Ⅱ型恒温恒湿培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；HNY-200B型恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；YX280A型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；HHS-2S型电子恒温不锈钢水浴锅：天津虞龙仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 面团的制备

面粉150 g，水80 mL，糖20 g，盐1.4 g，酵母2 g。再分割面团为80 g/个，在-35 ℃在速冻1 h后，在-20 ℃低温冰箱贮存7 d。

1.3.2 酵母存活率的测定[16]

取若干个100 mL锥形瓶，分别倒入50 mL YPD液体培养基，除空白组外，试验组添加一定量的抗冻保护剂，再用灭菌锅121 ℃条件下杀菌15 min；待培养基冷却后分别加入1 g干酵母，溶解混匀，30 ℃恒温摇床（150 r/min）培养14 h。

取1 mL培养液，进行适当的梯度稀释，再接种到YPD固体培养基上，30 ℃培养箱中培养48 h，取出然后用直接计数法数出培养皿中的菌落数，为冻前细胞数N1；取5 mL培养液于-30 ℃下冷冻7 d，再取出于30 ℃下解冻3～5 min，进行同等梯度稀释后接种在YPD固体培养基，30 ℃培养箱中培养48 h，取出后计数，为冻后细胞数N2，平行计数3次。酵母存活率=N1/N2×100%。

1.3.3 发酵力的测定

图1 发酵力测定装置Fig.1 Testing device of fermentation capacity

根据GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》测定酵母细胞在鲜面团和冷冻面团中的发酵力，实验装置如图1所示。测定方法：将制备好的冷冻面团迅速放入A瓶中，恒温水浴30 ℃解冻并发酵，C瓶收集排出液并读数，发酵前3 h排出液的体积即为酵母发酵力，mL。

1.3.4 单因素试验

选择海藻糖、甘油、NaCl、脯氨酸、葡萄糖5种抗冻保护剂（以质量分数计），在-30 ℃下冷冻7 d后测定酵母存活率和发酵力两个指标进行单因素试验，不同酵母抗冻保护剂的添加水平见表1。

表1 保护剂配方优化单因素试验Table 1 Factors and levels of single factor experiments for protectant formula optimization

1.3.5 二次旋转正交试验

根据1.3.1和1.3.2中的试验方法，以冷冻时间为7 d测存活率和发酵力两个指标，通过单因素试验筛选出抗冻性较好的3种抗冻保护剂及其因素水平，再进行3因素二次回归旋转正交试验优化保护剂配方，因素与水平编码见表2。

表2 二次旋转正交试验因素与水平编码Table 2 Factors and levels of quadratic rotation orthogonal experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 空白试验

空白试验结果见表3。由表3可知，空白组试验酵母存活率为30.12%，发酵力为180 mL。

表3 空白组试验结果Table 3 Results of blank test

2.1.2 海藻糖对试验结果的影响

海藻糖添加量对酵母存活率和发酵力的影响见图2。由图2结果可知，冷冻7 d后，酵母的存活率和发酵力在海藻糖添加量为1%～5%范围内是先上升后下降的趋势。且当海藻糖添加量为2%时，存活率和发酵力均是最高的，存活率为64.34%，发酵力为256 mL；与空白组相比，存活率提高了34个百分点，发酵力提高了80 mL左右。

图2 海藻糖添加量对存活率和发酵力的影响Fig.2 Effect of trehalose addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.3 甘油对试验结果的影响

甘油添加量对酵母存活率和发酵力的影响见图3。由图3结果可知，冷冻7 d后，酵母的存活率和面团的发酵力在甘油添加量为1%～9%范围内是先上升后下降的趋势。且当甘油添加量为3%时，存活率和发酵力均是最高的，存活率为65.98%，发酵力为262 mL；与空白组相比，酵母存活率上升了36个百分点，发酵力提高了80 mL左右。

图3 甘油添加量对存活率和发酵力的影响Fig.3 Effect of glycerol addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.4 NaCl对试验结果的影响

NaCl添加量对酵母存活率和发酵力的影响见图4。由图4可知，冷冻7 d后，酵母的存活率和面团的发酵力在NaCl添加量为1%～9%范围内呈一直下降的趋势，当添加量为1%时效果最佳，存活率为61.94%，发酵力为220 mL；说明盐含量过高不利于酵母存活和面团发酵。当添加量为1%时，与空白组相比，酵母存活率提高了32个百分点，发酵力提高了40 mL左右。

图4 NaCl添加量对存活率和发酵力的影响Fig.4 Effect of NaCl addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.5 脯氨酸对试验结果的影响

脯氨酸添加量对酵母存活率和发酵力的影响见图5。由图5结果可知，冷冻7 d后，酵母的存活率和发酵力在脯氨酸添加量为1%～5%范围内是先上升后下降的趋势。且当添加量为2%时，存活率和发酵力均是最高的，存活率为66.32%，发酵力为254 mL；与空白组相比，酵母存活率提高了36个百分点，发酵力提高了70 mL左右。

图5 脯氨酸添加量对存活率和发酵力的影响Fig.5 Effect of proline addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.6 葡萄糖对试验结果的影响

图6 葡萄糖添加量对存活率和发酵力的影响Fig.6 Effect of glucose addition on survival rates and fermentation capacity

葡萄糖对酵母存活率和发酵力的影响见图6。由图6结果可知，冷冻7 d后，酵母的存活率和发酵力在海藻糖添加量为2%～10%范围内是先上升后下降的趋势。且当添加量为4%时，存活率和发酵力均是最高的，存活率为62.04%，发酵力为238 mL；与空白组相比，酵母存活率提高了31个百分点，发酵力提高了60 mL左右。

2.2 二次回归正交优化试验

2.2.1 正交试验设计

综合评定5个单因素的存活率和发酵力指标，获得较好的3种酵母抗冻保护剂及其添加量分别是：海藻糖2%、甘油3%和脯氨酸2%。在此基础上进行二次旋转正交试验，结果见表4。

表4 二次旋转正交组合设计编码及试验结果Table 4 Coding and results of quadratics rotary orthogonal combination design

2.2.2 方差分析

以存活率和发酵力为评价指标，建立二次多项模型及对各项进行方差分析，结果分别见表5和表6。

由表5可知，除交互项x2x3外，回归方程及各项偏回归系数都达到显著水平。其中因素x1、x2、x3和x1x2都影响极显著，说明海藻糖、甘油、脯氨酸及海藻糖和甘油的交互作用对存活率的影响非常显著；x1x3为显著，说明海藻糖和甘油的交互作用对存活率的影响显著；x2x3为不显著，说明甘油和脯氨酸的交互作用对存活率的影响不大。

由表6可知，除交互项x1x3外，回归方程及各项偏回归系数都达到显著水平。其中因素x1、x2、x3和x1x2都影响极显著，说明海藻糖、甘油、脯氨酸及海藻糖和甘油的交互作用对发酵力的影响非常显著；x2x3为显著，说明甘油和脯氨酸的交互作用对发酵力的影响显著；x1x3为不显著，说明海藻糖和脯氨酸的交互作用对发酵力的影响不大。

表5 以存活率为评价指标的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment based on survival rates as index

表6 以发酵力为评价指标的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment based on survival rates as index

利用EXCEL数据处理工具做回归分析，得到回归方程结果见表7。

表7 存活率和发酵力回归分析Table 7 Regression analysis of survival rate and fermentation capacity

利用DPS软件对二次旋转正交试验进行分析，得到最佳抗冻剂的组合为x1=2.23，x2=3.43，x3=1.55。在此条件下进行验证试验，得到实验结果与预测值都较为接近。即海藻糖、甘油和脯氨酸添加量分别为2.23%、3.43%和1.55%时，酵母存活率和面团发酵力结果较优，存活率为85.86%，发酵力为322 mL。

3 结论

在单因素试验基础上，运用三因素二次回归正交旋转设计进行优选试验。根据显著回归方程，在对存活率影响试验中，因素主次顺序为：海藻糖＞甘油＞脯氨酸；在对发酵力影响试验中，因素主次顺序为：海藻糖＞脯氨酸＞甘油。综合存活率、发酵力和经济角度考虑，验证得到最优试验条件为：海藻糖、甘油和脯氨酸添加量分别为2.23%、3.43%和1.55%，在此条件下酵母存活率和面团发酵力结果较优，存活率为85.86%，发酵力为322 mL。

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