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白酒酒糟中产纤维素酶菌株的筛选及其酶活力特性检测

2015-04-12车振明关统伟

中国酿造 2015年8期
关键词:水解纤维素菌落

董 丹,车振明,关统伟*

(西华大学微生物研究所,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川 成都 610039)

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,广泛分布于自然界中。据统计,每年全球通过光合作用产生的纤维素总量达1.7×1012kg[1]。自然界中能产纤维素酶的微生物种类繁多,主要包括真菌,放线菌和部分酵母菌、部分细菌等[2]。纤维素酶多为糖蛋白,酶分子的一级结构由核心催化域(catalytic domain,CD)、纤维素结合域(cellulose binding domain,CBD)和将这两部分相连的链接区(linker)三部分组成,也有仅含核心催化区而无CBD区的纤维素酶,这类酶主要是水解水溶性纤维素[3-4]。

纤维素酶除了用于谷物发酵产酒外,还有很广泛的用途(应用于如食品、纺织、饲料、石油勘探、中药成分提取等领域[5-6]),作为一种绿色饲料添加剂,将饲料中的部分纤维素降解成可消化吸收的还原糖,提高饲料利用率[7-12]。目前,纤维素应用最成功的领域就是纤维素在工业上的大规模应用,如用酸性纤维素酶水洗整理牛仔布,这也是目前纤维素酶应用用量最大的领域[13]。目前纤维素酶制造成本还相对较贵,但其应用却日益广泛,因而要想其大量运用于商业领域,降低其成本就尤为重要。高产纤维素菌能大大降低纤维素酶的制造成本,因此高产纤维素酶菌株的筛选是关键问题之一。白酒是用谷物酿造而成的,但是目前仅仅是利用谷物中的淀粉来发酵生产酒,对谷物和谷物壳中的纤维素利用却很少。利用微生物发酵的方法,使纤维素在纤维素酶的酶促反应下水解成二糖和葡萄糖,从而不仅使谷物的利用率增加,提高了出酒率,也使得酒糟的营养价值提高和减轻了环境污染问题。

本实验从白酒糟中筛选产纤维素酶的菌株,并通过测定酶活力大小得出其最适生长pH值和温度,可为酒厂实际生产过程中充分利用纤维素酶提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

白酒酒糟:泸州老窖酿酒厂,采自2014年7月,密封保存于-20 ℃备用。

1.1.2 试剂

牛肉膏、蛋白胨、硫酸氢氨、氯化钠、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium-Na,CMC-Na)、磷酸氢二钾、硫酸镁、葡萄糖(均为分析纯):成都科龙化工试剂厂;3,5-二硝酸水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)(化学纯):南京欧特化工试剂厂。

1.1.3 培养基

筛选培养基:CMC-Na 1 g,琼脂2 g,(NH4)2SO40.25 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,定容至100 mL,pH值为7.2。

种子培养基:牛肉膏1 g,蛋白胨0.3 g,NaCl 0.5 g,定容至100 mL,pH值为7.0。

发酵产酶培养基:(NH4)2SO40.25 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,CMC-Na 0.6 g,葡萄糖0.4 g,定容至100 mL,pH值为7.0。

1.2 仪器与设备

DHP-9052电热恒温培养箱、DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;ZWY-1102C恒温培养振荡器:上海智城分析仪器制造有限公司;TDZS-WS冷冻离心机:上海卢湘仪;LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器:上海中安医疗器械厂;DYY-8C双定时电泳仪:北京市六一仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 产纤维素酶菌株的初筛

称取10 g白酒酒糟置于100 mL的锥形瓶中,加入90 mL无菌水,摇匀。取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液,用无菌移液枪分别移取100 μL各稀释液于筛选培养基,用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面,放置于37 ℃恒温培养箱中培养2~3 d,观察有无水解圈的产生,通过测定水解圈的大小来初步判定菌株酶活力的大小。

1.3.2 产纤维素酶菌株的复筛

(1)选取培养基上呈单菌落的菌,用无菌的竹签分别挑取不同形态的菌落进行分离纯化。放置于37 ℃恒温培养箱中培养2~3 d[14],重复此步骤直至每种菌为纯菌落。

(2)当培养的菌纯化后,向培养基里加入适量的2%刚果红溶液[15],染色15 min后用蒸馏水和1 mol/L氯化钠溶液清洗[16]。观察菌团周围有无水解圈,有水解圈的菌可初步判定为产纤维素酶菌株。菌落若产生羧甲基纤维素酶(CMCase),培养基中的羧甲基纤维素(CMC)将被分解,刚果红将不能吸附并着色,再用1 mol/L氯化钠溶液洗涤后,菌落周围就会形成透明圈,而平板中没有产生CMCase的菌落和其他部位仍为红色[17-18]。

(3)将产纤维素酶菌菌株保藏于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.3 产纤维素酶菌株的鉴定

DNA的提取:DNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)[19-20]法。得到的样品总DNA于-20 ℃保存,作为后续PCR的模板。

PCR及产物的纯化:以提取得到的DNA为模板,细菌选择通用引物Eμ27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3');1490R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。反应条件:95 ℃、4 min,95 ℃、60 s,56 ℃、60 s,72 ℃、120 s,35个循环;72 ℃、10 min。PCR反应体系为50 μL:10×Buffer 5 μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1μL、ddH2O37.5μL、DNA模板1 μL。PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳时间40 min。纯化过程按照DNA胶回收试剂盒中的步骤进行,具体步骤参照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit试剂盒说明。

测序:PCR产物纯化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast序列分析。

1.3.4 纤维素酶活力测定

(1)纤维素粗酶液的制备

将产纤维素酶菌株接种于种子培养基中,37 ℃、200 r/min摇床培养24 h后,取发酵液以2%的加样量加入发酵培养基,37 ℃、200 r/min 摇床培养24 h。培养后8 000 r/min常温离心10 min,取上清液为粗酶液测定纤维素酶活力。

(2)纤维素酶活力的测定方法

DNS试剂的配制:称取DNS 3.15 g,加水500 mL,搅拌5 s,45 ℃水浴。然后逐步加入100 mL 0.2 g/mL氢氧化钠溶液,同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(在加入氢氧化钠的过程中,溶液的温度不能超过48 ℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水硫酸钠2.50 g。继续45 ℃水浴加热,同时补水300 mL,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1 000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。室温条件下保存7 d后使用,有效期6个月。

葡萄糖标准曲线的测定见参考文献[21]。

羧甲基纤维素酶活定义:1 g固体酶(或1 mL液体酶),在指定温度和pH条件下,水解CMC-Na底物0.5 h,产生相当于1 mg葡萄糖的还原糖量,为一个酶活力单位,以U/g(或U/mL)表示。简写成CMCA-DNS[17]。

羧甲基纤维素(还原糖法)酶活测定过程:取1 mL粗制酶液与2 mL CMC-Na溶液(底物)在50 ℃水浴下混合反应30 min,取出后加入DNS试剂3.0 mL[18],放入沸水浴中加热10 min,取出后用流水迅速冷却至室温,蒸馏水定容至20 mL,分光光度计在波长540 nm处测定OD值,通过葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量,根据产生1 mg葡萄糖的还原糖量,为一个酶活力单位为计算方法,计算出具体的酶活(空白试验除先灭酶外,其余条件不变)。

1.3.5 最适温度的测定

将1 mL粗制酶液与2 mL的CMC-Na溶液混合后,分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃条件下反应30 min后测定其酶活。

1.3.6 最适pH值的测定

将1 mL粗制酶液与2 mL的CMC-Na溶液混合后,放置在温度30 ℃条件,调节pH值分别为2、3、4、5、6、7条件下反应后,测定其酶活。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌种筛选结果

2.1.1 菌株初筛结果

表1 产纤维素酶菌株的初筛结果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-producing strain

由表1可知,菌株p1004的水解圈最大,菌株p1001的水解圈次之,水解圈最小的是菌株p1002。

2.1.2 菌株复筛结果

将初筛得到的菌株进行分离纯化,待菌落长成后选择透明圈较大、菌落较小的菌株进行发酵培养。对菌落进行刚果红染色,初筛得到的3株产纤维素菌株产生的透明圈的效果明显,其中菌株p1001和p1004的透明圈更加明显。

2.1.3 葡萄糖标准曲线的绘制以及纤维素酶活力的测定

通过绘制的葡萄糖标准曲线方程为y=0.616 1x-0.030 7(R2=0.996 4),根据标准曲线计算出3株菌的酶活力。在p1001、p1002、p1004三株菌株中,酶活力最高的菌株为p1004,酶活力大小为1.23 U/mL,约为p1001、p1002酶活力的两倍。

2.2 产纤维素酶菌种的鉴定

表2 菌株分子鉴定结果Table 2 Identification results of strains

由表2可知,这三株菌同属于一个属即芽孢杆菌属(Bacillus)。经鉴定p1001为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),p1002为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),p1004为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),与其相似菌株的相似度分别为100%、100%、99%。

2.3 温度对菌株酶活力的影响

将不同纤维素粗制酶液与底物在不同的温度条件下反应后,得到酶活力随温度变化的曲线如图1所示。

图1 温度对菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

从图1A可以看出,菌株p1001在20~45 ℃酶活力缓慢上升,45~55 ℃酶活力快速上升,55~80 ℃酶活力快速下降,最适生长温度为55 ℃。从图1B可以看出,菌株p1002在20~40 ℃酶活力缓慢上升,40~55 ℃酶活力快速上升,55~70 ℃酶活力快速下降,70~80 ℃酶活力下降趋势稍微变缓,最适生长温度为55 ℃。从图1C可以看出,菌株p1004在20~40 ℃酶活力缓慢上升,40~55 ℃酶活力快速上升,55~60 ℃酶活力缓慢下降,60~80 ℃酶活力下降速率增加,最适生长温度为55 ℃。故三种菌株的最适生长温度均为55 ℃。

三株菌的酶活力随温度的变化情况都出现了先增后减的情况,随着温度从低温升至55 ℃时,在最适温度下,细胞生长最快,细胞膜的通透性最强,因此在此条件下,细菌内酶活力最强,当温度持续升高的过程中,高温破坏了细菌的细胞结构,致使细菌不能正常的进行新陈代谢,以至于抑制了细菌正常的产酶功能,酶活力降低,故最适温度为55 ℃。

2.4 pH值对菌株酶活力的影响

将纤维素粗酶液与底物在不同pH条件下反应后,得到酶活力随pH值变化的曲线如图2所示。

图2 pH对菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

从图2可知,菌株p1001在pH值为2~4时,菌株p1002和p1004在pH值为2~5时,酶活力随pH值的增加而增加,pH值在5时达到最大值,在pH值>5时,酶活力随pH值的增加急剧下降。因此三种菌株的最适生长pH值均为5。

酶在最适pH范围内表现出活性,大于或小于最适的pH值,都会降低酶活性。主要是因为pH值的不同会改变底物分子和酶分子的带电状态,从而影响酶和底物的结合;过高或过低的pH值都会影响酶的稳定性,进而使酶遭受不可逆的破坏,因此最适pH值为5。

3 结论

长期以来,酶的产量和酶活力低一直是制约纤维素酶实际应用的一个重要原因,因此,不断的筛选高产纤维素酶菌株,对纤维素资源的利用有着重要的意义。本实验中分离得到的三株产纤维素酶菌株的最适产酶温度都为55 ℃,pH值为5。菌株p1004所产纤维素酶最大酶活为1.2 U/mL,约为菌株p1001和p1002最大酶活的两倍。因此,利用菌株p1004来提高纤维素酶产量具有一定的实用价值,为后期解决纤维素酶产量低、活力低等问题提供了理论基础。

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