白酒酒糟中产纤维素酶菌株的筛选及其酶活力特性检测

董 丹，车振明，关统伟*

（西华大学微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039）

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，广泛分布于自然界中。据统计，每年全球通过光合作用产生的纤维素总量达1.7×1012kg[1]。自然界中能产纤维素酶的微生物种类繁多，主要包括真菌，放线菌和部分酵母菌、部分细菌等[2]。纤维素酶多为糖蛋白，酶分子的一级结构由核心催化域（catalytic domain，CD）、纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）和将这两部分相连的链接区（linker）三部分组成，也有仅含核心催化区而无CBD区的纤维素酶，这类酶主要是水解水溶性纤维素[3-4]。

纤维素酶除了用于谷物发酵产酒外，还有很广泛的用途（应用于如食品、纺织、饲料、石油勘探、中药成分提取等领域[5-6]），作为一种绿色饲料添加剂，将饲料中的部分纤维素降解成可消化吸收的还原糖，提高饲料利用率[7-12]。目前，纤维素应用最成功的领域就是纤维素在工业上的大规模应用，如用酸性纤维素酶水洗整理牛仔布，这也是目前纤维素酶应用用量最大的领域[13]。目前纤维素酶制造成本还相对较贵，但其应用却日益广泛，因而要想其大量运用于商业领域，降低其成本就尤为重要。高产纤维素菌能大大降低纤维素酶的制造成本，因此高产纤维素酶菌株的筛选是关键问题之一。白酒是用谷物酿造而成的，但是目前仅仅是利用谷物中的淀粉来发酵生产酒，对谷物和谷物壳中的纤维素利用却很少。利用微生物发酵的方法，使纤维素在纤维素酶的酶促反应下水解成二糖和葡萄糖，从而不仅使谷物的利用率增加，提高了出酒率，也使得酒糟的营养价值提高和减轻了环境污染问题。

本实验从白酒糟中筛选产纤维素酶的菌株，并通过测定酶活力大小得出其最适生长pH值和温度，可为酒厂实际生产过程中充分利用纤维素酶提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

白酒酒糟：泸州老窖酿酒厂，采自2014年7月，密封保存于-20 ℃备用。

1.1.2 试剂

牛肉膏、蛋白胨、硫酸氢氨、氯化钠、羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium-Na，CMC-Na）、磷酸氢二钾、硫酸镁、葡萄糖（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；3,5-二硝酸水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（化学纯）：南京欧特化工试剂厂。

1.1.3 培养基

筛选培养基：CMC-Na 1 g，琼脂2 g，（NH4）2SO40.25 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，定容至100 mL，pH值为7.2。

种子培养基：牛肉膏1 g，蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，定容至100 mL，pH值为7.0。

发酵产酶培养基：（NH4）2SO40.25 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CMC-Na 0.6 g，葡萄糖0.4 g，定容至100 mL，pH值为7.0。

1.2 仪器与设备

DHP-9052电热恒温培养箱、DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；ZWY-1102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；TDZS-WS冷冻离心机：上海卢湘仪；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器：上海中安医疗器械厂；DYY-8C双定时电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 产纤维素酶菌株的初筛

称取10 g白酒酒糟置于100 mL的锥形瓶中，加入90 mL无菌水，摇匀。取混合后溶液的上清液按10倍稀释法依次稀释成10-2、10-3、10-4倍的稀释溶液，用无菌移液枪分别移取100 μL各稀释液于筛选培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面，放置于37 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，观察有无水解圈的产生，通过测定水解圈的大小来初步判定菌株酶活力的大小。

1.3.2 产纤维素酶菌株的复筛

（1）选取培养基上呈单菌落的菌，用无菌的竹签分别挑取不同形态的菌落进行分离纯化。放置于37 ℃恒温培养箱中培养2～3 d[14]，重复此步骤直至每种菌为纯菌落。

（2）当培养的菌纯化后，向培养基里加入适量的2%刚果红溶液[15]，染色15 min后用蒸馏水和1 mol/L氯化钠溶液清洗[16]。观察菌团周围有无水解圈，有水解圈的菌可初步判定为产纤维素酶菌株。菌落若产生羧甲基纤维素酶（CMCase），培养基中的羧甲基纤维素（CMC）将被分解，刚果红将不能吸附并着色，再用1 mol/L氯化钠溶液洗涤后，菌落周围就会形成透明圈，而平板中没有产生CMCase的菌落和其他部位仍为红色[17-18]。

（3）将产纤维素酶菌菌株保藏于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.3 产纤维素酶菌株的鉴定

DNA的提取：DNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）[19-20]法。得到的样品总DNA于-20 ℃保存，作为后续PCR的模板。

PCR及产物的纯化：以提取得到的DNA为模板，细菌选择通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应条件：95 ℃、4 min，95 ℃、60 s，56 ℃、60 s，72 ℃、120 s，35个循环；72 ℃、10 min。PCR反应体系为50 μL：10×Buffer 5 μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1μL、ddH2O37.5μL、DNA模板1 μL。PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间40 min。纯化过程按照DNA胶回收试剂盒中的步骤进行，具体步骤参照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit试剂盒说明。

测序：PCR产物纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blast序列分析。

1.3.4 纤维素酶活力测定

（1）纤维素粗酶液的制备

将产纤维素酶菌株接种于种子培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养24 h后，取发酵液以2%的加样量加入发酵培养基，37 ℃、200 r/min 摇床培养24 h。培养后8 000 r/min常温离心10 min，取上清液为粗酶液测定纤维素酶活力。

（2）纤维素酶活力的测定方法

DNS试剂的配制：称取DNS 3.15 g，加水500 mL，搅拌5 s，45 ℃水浴。然后逐步加入100 mL 0.2 g/mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明（在加入氢氧化钠的过程中，溶液的温度不能超过48 ℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水硫酸钠2.50 g。继续45 ℃水浴加热，同时补水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1 000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温条件下保存7 d后使用，有效期6个月。

葡萄糖标准曲线的测定见参考文献[21]。

羧甲基纤维素酶活定义：1 g固体酶（或1 mL液体酶），在指定温度和pH条件下，水解CMC-Na底物0.5 h，产生相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为一个酶活力单位，以U/g（或U/mL）表示。简写成CMCA-DNS[17]。

羧甲基纤维素（还原糖法）酶活测定过程：取1 mL粗制酶液与2 mL CMC-Na溶液（底物）在50 ℃水浴下混合反应30 min，取出后加入DNS试剂3.0 mL[18]，放入沸水浴中加热10 min，取出后用流水迅速冷却至室温，蒸馏水定容至20 mL，分光光度计在波长540 nm处测定OD值，通过葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量，根据产生1 mg葡萄糖的还原糖量，为一个酶活力单位为计算方法，计算出具体的酶活（空白试验除先灭酶外，其余条件不变）。

1.3.5 最适温度的测定

将1 mL粗制酶液与2 mL的CMC-Na溶液混合后，分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃条件下反应30 min后测定其酶活。

1.3.6 最适pH值的测定

将1 mL粗制酶液与2 mL的CMC-Na溶液混合后，放置在温度30 ℃条件，调节pH值分别为2、3、4、5、6、7条件下反应后，测定其酶活。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌种筛选结果

2.1.1 菌株初筛结果

表1 产纤维素酶菌株的初筛结果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-producing strain

由表1可知，菌株p1004的水解圈最大，菌株p1001的水解圈次之，水解圈最小的是菌株p1002。

2.1.2 菌株复筛结果

将初筛得到的菌株进行分离纯化，待菌落长成后选择透明圈较大、菌落较小的菌株进行发酵培养。对菌落进行刚果红染色，初筛得到的3株产纤维素菌株产生的透明圈的效果明显，其中菌株p1001和p1004的透明圈更加明显。

2.1.3 葡萄糖标准曲线的绘制以及纤维素酶活力的测定

通过绘制的葡萄糖标准曲线方程为y=0.616 1x-0.030 7（R2=0.996 4），根据标准曲线计算出3株菌的酶活力。在p1001、p1002、p1004三株菌株中，酶活力最高的菌株为p1004，酶活力大小为1.23 U/mL，约为p1001、p1002酶活力的两倍。

2.2 产纤维素酶菌种的鉴定

表2 菌株分子鉴定结果Table 2 Identification results of strains

由表2可知，这三株菌同属于一个属即芽孢杆菌属（Bacillus）。经鉴定p1001为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），p1002为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），p1004为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），与其相似菌株的相似度分别为100%、100%、99%。

2.3 温度对菌株酶活力的影响

将不同纤维素粗制酶液与底物在不同的温度条件下反应后，得到酶活力随温度变化的曲线如图1所示。

图1 温度对菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

从图1A可以看出，菌株p1001在20～45 ℃酶活力缓慢上升，45～55 ℃酶活力快速上升，55～80 ℃酶活力快速下降，最适生长温度为55 ℃。从图1B可以看出，菌株p1002在20～40 ℃酶活力缓慢上升，40～55 ℃酶活力快速上升，55～70 ℃酶活力快速下降，70～80 ℃酶活力下降趋势稍微变缓，最适生长温度为55 ℃。从图1C可以看出，菌株p1004在20～40 ℃酶活力缓慢上升，40～55 ℃酶活力快速上升，55～60 ℃酶活力缓慢下降，60～80 ℃酶活力下降速率增加，最适生长温度为55 ℃。故三种菌株的最适生长温度均为55 ℃。

三株菌的酶活力随温度的变化情况都出现了先增后减的情况，随着温度从低温升至55 ℃时，在最适温度下，细胞生长最快，细胞膜的通透性最强，因此在此条件下，细菌内酶活力最强，当温度持续升高的过程中，高温破坏了细菌的细胞结构，致使细菌不能正常的进行新陈代谢，以至于抑制了细菌正常的产酶功能，酶活力降低，故最适温度为55 ℃。

2.4 pH值对菌株酶活力的影响

将纤维素粗酶液与底物在不同pH条件下反应后，得到酶活力随pH值变化的曲线如图2所示。

图2 pH对菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

从图2可知，菌株p1001在pH值为2～4时，菌株p1002和p1004在pH值为2～5时，酶活力随pH值的增加而增加，pH值在5时达到最大值，在pH值＞5时，酶活力随pH值的增加急剧下降。因此三种菌株的最适生长pH值均为5。

酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适的pH值，都会降低酶活性。主要是因为pH值的不同会改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；过高或过低的pH值都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆的破坏，因此最适pH值为5。

3 结论

长期以来，酶的产量和酶活力低一直是制约纤维素酶实际应用的一个重要原因，因此，不断的筛选高产纤维素酶菌株，对纤维素资源的利用有着重要的意义。本实验中分离得到的三株产纤维素酶菌株的最适产酶温度都为55 ℃，pH值为5。菌株p1004所产纤维素酶最大酶活为1.2 U/mL，约为菌株p1001和p1002最大酶活的两倍。因此，利用菌株p1004来提高纤维素酶产量具有一定的实用价值，为后期解决纤维素酶产量低、活力低等问题提供了理论基础。

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