中药复方对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其抑制血管新生机制初步探讨

王克强，陶 琳，王绪淮

(莱芜市妇幼保健院，山东莱芜 271199)

中药复方对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其抑制血管新生机制初步探讨

王克强，陶 琳，王绪淮

(莱芜市妇幼保健院，山东莱芜 271199)

目的:观察中药复方肺金生方对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长和对新生血管的影响，初步阐明其可能的作用机制。方法:选取成功构建Lewis肺癌移植瘤模型C57BL/6小鼠48只，按随机数字表法分为荷瘤对照组、顺铂组、肺金生方低剂量组、肺金生方高剂量组4组，每组12只，分别以相应药物干预2周，取瘤块称重，计算肿瘤抑制率;采用SABC免疫组化法检测Lewis肺癌小鼠肿瘤组织的微血管密度(MVD);采用western blot法检测Lewis肺癌小鼠肿瘤组织的血管内皮生长因子(VEGF)蛋白和碱性纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:各组肿瘤质量中，顺铂组(1.65±0.15)g、肺金生方低剂量组(2.42±0.19)g、高剂量组(1.83± 0.16)g与荷瘤对照组(3.13±0.21)g比较差异有统计学意义;各组对Lewis肺癌小鼠肿瘤的抑瘤率分别为:荷瘤对照组0，顺铂组46.61%，肺金生方低剂量组27.32%，肺金生方高剂量组44.29%;各组MVD的值中，顺铂组(16.74±0.96)个，肺金生方低剂量组(19.31±0.85)个、肺金生方高剂量组(17.21±0.77)个与荷瘤对照组(29.98±1.06)个比较差异有统计学意义;Western blot结果显示，各治疗组的VEGF和bFGF蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义;肺金生方高剂量组VEGF和bFGF蛋白的表达与顺铂组比较差异无统计学意义。结论:肺金生方可抑制血管新生对抗Lewis肺癌，其机制可能与抑制VEGF和bFGF相关。

中药复方肺金生方;Lewis肺癌;血管内皮生长因子;碱性纤维细胞生长因子

肺癌尤其是原发性支气管肺癌(Primary lung cancer)已经成为全球常见的恶性肿瘤之一。研究表明，我国肺癌的病死率在近30年内已经上升至46.5%，居于恶性肿瘤死亡原因的首位［1］。血管新生(angiogenesis)在机体的多种生理和病理过程中都起着至关重要的作用。肺癌作为常见的恶性肿瘤，血管新生同样是该实体瘤增殖、侵袭和转移的决定性因素，因此抗血管新生成是临床上治疗肺癌的一个关键靶点。肺金生方是由《金匮要略》经典方泽漆汤与现代药理实验结果相结合转化而成的新方，其用于临床治疗肺癌疗效相当显著。尽管近年来对于肺金生方在临床疗效上的报道逐渐增多，但对其治疗肺癌的作用机制研究极为少见。本研究采用C57BL/6小鼠构建Lewis肺癌移植瘤模型，观察中药复方肺金生方对其肿瘤生长和抑制率的影响，探究血管新生的相关指标微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白和碱性纤维细胞生长因子(bFGF)的表达情况，以此探讨肺金生方对肺癌治疗的可能作用机制，以求为肺金生方的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

肺金生方由泽漆30 g、前胡10 g、人参、桂枝各9 g、红豆杉枝8 g、蜂房15 g、石见穿30 g等组成，参照文献［2］肺金生方低、高剂量分别相当于临床成人用量的5、20倍，常规水煎浓缩成0.925、3.7 g/mL。灭菌后于4℃冰箱备用;顺铂20 mg/瓶，齐鲁制药厂(生产批号017023);达尔伯克氏培养基(DMEM):美国 Gibco BRL公司;胎牛血清(FBS):美国Hyclone公司;一抗:MVD、VEGF、bFGF和β-actin均购自美国 Santa cruz生物技术公司;电化学发光(ECL)试剂盒:上海碧云天生物技术公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物与细胞

50只健康雄性C57BL/6小鼠，体质量(20±2) g，购于上海斯莱克实验动物有限公司(许可证号SCKK(沪)2007-0005)。Lewis肺癌细胞株购自上海医药工程研究院。

1.3 主要实验仪器

MCO-175型CO2培养箱:日本SANYO公司; SW-CJ-1F型洁净工作台:苏净集团安泰公司; Olympus CKX41型倒置显微镜:日本Olympus公司; Gel DOC XR凝胶成像分析系统:美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 Lewis肺癌细胞培养

将Lewis肺癌细胞株接种于培养瓶中，采用DMEM培养液(含10%FBS)置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，待细胞贴壁后取对数生长期的细胞消化传代。

2.2 C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型建立及分组处理

取对数期Lewis肺癌细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度 1×107个/mL，于 20 min内每只C57BL/6小鼠右上肢腋窝皮下接种隔日观察。接种5 d后待移植瘤长至直径0.3～0.5 cm时，选取荷瘤成功的小鼠48只，按随机数字表法分为荷瘤对照组、顺铂组，肺金生方低剂量组、肺金生方高剂量组每组各12只。接种5 d后晨起空腹给药，荷瘤对照组给予0.9%氯化钠溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;顺铂组于开始给药的第1、3、5天尾静脉给予顺铂注射液1 mL(含顺铂0.1 mg)，同时给予0.9 %氯化钠溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;肺金生方低、高剂量组分别给予相应浓度的肺金生方0.4 mL灌胃，每日1次，共2周。

2.3 肺金生方的肿瘤抑制率计算

灌胃14 d后动物禁食不禁水12 h，脱颈处死后剥取瘤块，完整剥取腋窝皮下肿瘤，去除血污脂肪等，电子天平称取瘤质量。按照公式:抑瘤率=(1－用药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%，计算肿瘤抑制率。

2.4 C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤微血管密度(MVD)检测

采用 SABC免疫组化方法，结果判定采用Weidner改进方法［3］。选择最密集的5个微血管标记区，记录5个视野内的微血管数 ，取其均数为MVD的值。

2.5 Western blot法检测VEGF、dFGF蛋白表达情况

随机取出冻存的肿瘤组织，于液氮中迅速研磨加入细胞裂解液，冰上裂解30 min后，置4℃、12 000 g离心15 min取上清，BCA蛋白定量后，40 μg蛋白15%分离胶和5%浓缩胶SDS-PAGE电泳、转膜。5% 脱脂奶粉封闭4 h，一抗(VEGF、dFGF 1∶1 000)4℃过夜。PBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1∶50 000)温育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL试剂曝光，凝胶成像分析目标蛋白条带灰度值并进行比较。

2.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察

给药2周后，各组C57BL/6小鼠均成活。荷瘤对照组小鼠活动明显减少，对外界刺激反应不明显，每日进食量减少，皮肤光泽不强。肺金生方低剂量组小鼠活动尚可，每日进食量尚可，皮肤光泽尚可。顺铂组和肺金生方高剂量组小鼠活动尚可，对外界刺激反应灵敏，每日进食量尚可，皮肤光泽度明显优于其他组，提示肺金生方高剂量组小鼠与顺铂组小鼠生活质量优于其他组。

3.2 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠的肿瘤抑制率的影响

表1显示，造模后各组均生成肿瘤，各组灌胃给药14 d，脱颈处死后取瘤称重结果，各组肿瘤质量为荷瘤对照组(3.13±0.21)g、顺铂组(1.65±0.15) g、肺金生方低剂量组(2.42±0.19)g、肺金生方高剂量组(1.83±0.16)g。顺铂组、肺金生方低、高剂量组与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，肺金生方高剂量组与顺铂组比较差异无统计学意义(P＞0.05);各组对Lewis肺癌小鼠肿瘤的抑瘤率分别为荷瘤对照组0，顺铂组46.61%，肺金生方低剂量组27.32%，肺金生方高剂量组44.29 %。

表1 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤抑制率影响(±s)

表1 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤抑制率影响(±s)

注:与荷瘤对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 动物数量(只)瘤质量(g)抑瘤率(%) 44.29 12 3.13±0.21 0顺 铂 组 12 1.65±0.15＊＊ 46.61肺金生方低剂量组 12 2.42±0.19＊＊ 27.32肺金生方高剂量组 12 1.83±0.16＊＊荷 瘤 对 照 组

3.3 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的影响

表2显示，采用 SABC免疫组化方法，各组MVD值分别为荷瘤对照组(29.98±1.06)个，顺铂组(16.74±0.96)个，肺金生方低剂量组(19.31± 0.85)个，肺金生方高剂量组(17.21±0.77)个;顺铂组、肺金生方低、高剂量组与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肺金生方高剂量组与顺铂组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影响(±s)

表2 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影响(±s)

注:与荷瘤对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 动物数量/只 平均MVD/个12 29.98±1.06顺 铂 组 12 16.74±0.96＊＊肺金生方低剂量组 12 19.31±0.85＊＊肺金生方高剂量组 12 17.21±0.77荷 瘤 对 照 组＊＊

3.4 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表达的影响

表3图1显示，经Western blot法检测后，顺铂和肺金生方低剂量、高剂量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表达;肺金生方低剂量组VEGF和bFGF蛋白的表达量与荷瘤模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);顺铂组和肺金生方高剂量组的VEGF和bFGF蛋白表达量与荷瘤模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肺金生方高剂量组VEGF和bFGF蛋白表达与顺铂组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

4 讨论

目前，肺癌已成为国内外最为常见的恶性肿瘤之一，而临床上对于肺癌的治疗除手术切除病灶以外，术后采用放化疗是最为常见的辅助治疗方法，但治疗效果并不尽如人意［4］。肺癌尤其是原发性肺癌的发病率逐渐升高，因此在治疗上迫切需要药物的不断更新和新药的临床应用。我国是中医大国，从中医角度分析，肺癌患者肺组织中积块的产生是与正气亏虚、邪毒入侵、气机不利、气血痰搏结有关［5］，因此降气消痰为治疗良方。肺金生方来源于《金匮要略》经典方泽漆汤，方中以泽漆为君，功专消痰行水，人参助泽漆逐水消痰、扶正固本;桂枝、前胡、生姜温阳化饮、降气消痰;人参、甘草健脾以扶正气，佐黄芩以清泄水饮久留所化之郁热，加用蜂房、红豆杉散结消肿，共奏补肺散结、化气消痰、止咳平喘之功［6］。该方已被用作肺虚痰阻型非小细胞肺癌的临床治疗方。庞德湘等［2］研究发现，该方可以抑制Lewis肺癌小鼠自发肺转移，但对于肺癌发生发展的另一个重要因素血管新生的影响并没有做深入探讨，为此本研究从该靶点出发进行研究。

表3 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表达的影响(±s)

表3 肺金生方对C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表达的影响(±s)

注:与荷瘤对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 动物数量/只 灰度值荷 瘤 对 照 组VEGF灰度值/ β-actin灰度值bFGF灰度值/ β-actin 12 0.889±0.021 1.013±0.062顺 铂 组 12 0.482±0.043＊＊0.591±0.037＊＊肺金生方低剂量组 12 0.729±0.045* 0.893±0.021*肺金生方高剂量组 12 0.513±0.017＊＊0.615±0.034＊＊

自1971年美国Folkman系统地提出了肿瘤血管生成的假说，认为实体瘤在2～3mm3时没有新生的血管，若实体瘤继续生长，就需要血管的保障来供应增殖所需的营养物质，因此抑制血管新生成为治疗肿瘤的新靶点［7］。新生血管的生成是实体瘤细胞增殖的重要因素，研究发现肿瘤微血管密度( Microvascular density，MVD)增加后，肿瘤细胞的侵袭和转移能力会随之提升，且肿瘤的恶性潜能也会随之加大［8］。因此，MVD可以作为肿瘤细胞转移、复发和预后的一个关键标志物，在肿瘤血管生成的评估中，可以衡量血管生成的活性，还可以检测血管生成的强度，也可以作为一个稳定的评价指标来评估抗肿瘤血管生成药物的治疗效果。本研究结果显示，肺金生方低剂量和高剂量均能降低C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的数量，与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

Folkman还指出，血管新生过程涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的平衡，一旦失衡将会严重影响血管的生成，这一过程还涉及到促血管生成因子的分泌以及内源性血管生成抑制因子产生的相应减少［7］。目前，已知血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是最重要的血管生长刺激因子［9-10］。VEGF作为促血管内皮增殖的细胞调控因子，通过与血管内皮细胞的特异性受体结合，促内皮增殖促血管生成，是目前所知作用最强的和特异性最高且与血小板衍生生长因子(PDGF)有1/5的同源性，几乎在所有人体肿瘤和肿瘤细胞株中高表达［11］。bFGF可促进内皮中胚层或外胚层来源的细胞有丝分裂过程，是一种强有力的血管生成诱导因子。由于组织和细胞的差异，不同的bFGF亚型表现出不同的表达模式，在大部分非小细胞肺癌中均能检测到bFGF的高表达，说明bFGF与肿瘤疾病的发展和预后密切相关［12］。另外，bFGF还与VEGF有协同作用，两者与相应的特异性受体结合后，可通过一系列的信号传导到通路促进新的血管生成［13］。

在本研究中我们发现，顺铂和肺金生方低剂量、高剂量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表达;肺金生方低剂量组VEGF和bFGF蛋白的表达量与荷瘤模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);顺铂组和肺金生方高剂量组VEGF和bFGF蛋白表达量与荷瘤模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肺金生方高剂量组VEGF和bFGF蛋白表达与顺铂组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。因此我们认为，肺金生方可以通过抑制VEGF、bFGF等表达来实现抑制Lewis肿瘤血管生成的作用，进而达到抑制 Lewis肺癌的效用。但中药的组成和合成是个复杂的多因素过程，其抗肿瘤细胞的作用机制也是多靶点、多通路的，因此我们需要进一步研究、确定肺金生方对肿瘤血管新生抑制作用的具体特异性有效靶点。

［1］中华人民共和国卫生部.第三次全国死因调查主要情况［J］.中国肿瘤，2008，17(5):344-345.

［2］庞德湘，周楠，边至慰.肺金生方对Lewis肺癌小鼠VEGF-C、nm23表达的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2012(8):602-604.

［3］Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoring microvessel density with breast carcinoma and other solid tumor［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169-175.

［4］Nagata Y，Wulf J，Lax I，et al.Stereotactic radiotherapy of primary lung cancer and other targets:results of consultant meeting of the International Atomic Energy Agency［J］.International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2011，79(3):660-669.

［5］梁靓靓，陈苏宁，蔡玉文.调气消积汤对Lewis肺癌移植瘤血管生成影响的实验研究［J］.中国中医药科技，2011(18): 4，284-286.

［6］庞德湘，周楠，边至慰.肺金生方含药血清对A549细胞生长及MMP-2表达的影响［J］.中外健康文摘，2012，47(8): 168-170.

［7］Folkman J.Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease［J］.Nature medicine，1995，1(1):27-30.

［8］Cocks M，Shaw C S，Shepherd S O，et al.Sprint interval and endurance training are equally effective in increasing muscle microvascular density and eNOS content in sedentary males［J］.The Journal of physiology，2013，591(3):641-656.

［9］Chatterjee S，Heukamp L C，Siobal M，et al.Tumor VEGF: VEGFR2 autocrine feed-forward loop triggers angiogenesis in lung cancer［J］.The Journal of clinical investigation，2013，123 (4):1732.

［10］Zhao M，Gao F H，Wang J Y，et al.JAK2/STAT3 signaling pathway activation mediates tumor angiogenesis by upregulation of VEGF and bFGF in non-small-cell lung cancer［J］.Lung cancer，2011，73(3):366-374.

［11］Peterson J E，Zurakowski D，Italiano Jr J E，et al.VEGF，PF4 and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients［J］.Angiogenesis，2012，15(2):265-273.

［12］Farhat F S，Tfayli A，Fakhruddin N，et al.Expression，prognostic and predictive impact of VEGF and bFGF in non-small cell lung cancer［J］.Critical reviews in oncology/hematology，2012，84(2):149-160.

［13］Lee J S，Hirsh V，Park K，et al.Vandetanib versus placebo in patients with advanced non-small-cell lung cancer after prior therapy with an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor: A randomized， double-blind phase III trial (ZEPHYR)［J］.Journal of Clinical Oncology，2012，30(10): 1114-1121.

Inhibitory Effect of Chinese Herbal Compound on Lewis Lung Cancer in Mice and Its Inhibition of Angiogenesis Mechanism

WANG Ke-qiang，TAO Lin，WANG Xu-huai
(Laiwu City，MCH，Shandong Laiwu 271199，China)

Objective:To observe the effects of traditional Chinese medicine compound lung Jinsheng prescription to the Lewis lung cancer tumor growth and angiogenesis in mice，preliminary to elucidate its possible mechanism.Methods: Lewis lung tumor was successfully constructed model C57BL/6 48 mice were randomly divided into 4 groups:control group，tumor-bearing，cisplatin group，lungs UBUKATA low dose group，high dose lung Jinsheng groups，each group had 12 mices.Respectively corresponding drug intervention two weeks，the tumor was weighed to calculate the tumor inhibition rate;western blot assay using mice with Lewis lung tumor tissue;using SABC immunohistochemical assay mice with Lewis lung tumor microvessel density(MVD)vascular endothelial growth factor(VEGF)and basic fibroblast protein growth factor(bFGF)expression.Results:The tumor mass in each group，cisplatin group(1.65±0.15 g)，lung Jinsheng low dosage(2.42±0.19 g)，high-dose group(1.83±0.16 g)and tumor-bearing control group(3.13±0.21 g)were statistically significant compared;inhibition rate of each group of mice with Lewis lung tumors were:tumor-bearing control group 0，cisplatin group 46.61%，lung Jinsheng low dosage group 27.32% ，44.29%of lung Jinsheng high dose group; MVD values in each group，cisplatin group(16.74±0.96 unit)，lung Jinsheng prescription low dose group(19.31± 0.85 unit)，lung Jinsheng high dose group(17.21±0.77 unit)and tumor-bearing control group(29.98±1.06 unit) were statistically significant compared with;Western blot showed that the expression of VEGF and bFGF treatment group were lower than the model group protein，the difference was statistically significant;lung Jinsheng high dose groups of VEGF and bFGF protein expression compared with cisplatin group，the difference was not statistically significant.Conclusion:Pulmonary Jinsheng only inhibit angiogenesis against Lewis lung carcinoma，which may be associated with inhibition of VEGF and bFGF.

Traditional Chinese medicine lung Jinsheng party;Lewis lung carcinoma;Vascular endothelial growth factor;Basic fibroblast growth factor

R285.5

B

1006-3250(2015)06-0671-04

2015-03-09

王克强，主管药师，医学本科，从事中医药的实验与研究。