植物提取物抑制酪氨酸酶作用的研究进展

◎肖 雪 许歆瑶 李 洁

(华东理工大学 药学院，上海 201424)

酪氨酸酶（EC1.14.18.1）是一种含铜的金属酶，普遍存在于植物，动物，真菌和细菌中。酪氨酸酶具有单酚加羟酶和二酚氧化酶的活性，其催化反应过程：首先催化单酚为二酚，再将二酚催化为醌类化合物，醌类在无酶条件下聚合为黑色素类。酪氨酸酶是目前已知的生物体中唯一参与黑色素合成的关键酶[1]，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮肤色素细胞中酪氨酸酶的代谢，阻止色素沉着，达到美白效果。目前应用的化学合成的酪氨酸酶抑制剂的安全性较差，而天然植物提取物具有无毒，安全等特点。因此植物提取物抑制酪氨酸酶研究越来越受到国内外的关注，也具有较大的市场潜力。本文对近些年研究的植物提取物进行简要综述。

1 植物提取物分类

1.1 黄酮类及其衍生物

黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一类化合物，常以游离态或与糖结合成苷的形式存在于几乎每种植物体内。黄酮类化合物是两个苯环（A环和B环）中间通过三碳链互相连接而成的一系列化合物，黄酮体可以分为黄酮类，黄酮醇类，二氢黄酮类，二氢黄酮醇类，异黄酮类，二氢异黄酮类，查耳酮类，二氢查耳酮类，花色素类等。A,B环上常见的取代基有羟基，甲氧基，异戊烯基等，组成苷的糖常见的有D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-葡萄糖醛酸等。

N.Saewan[2]等人用乙酸乙酯提取Blumea balsamifera叶子，用硅胶柱层析法分离出二氢黄酮醇和二氢槲皮素-4'-甲基乙醚，二氢槲皮素-7,4'-二甲基乙醚，rhamnetin（鼠李素），tamarixetin（怪柳黄素）皆对酪氨酸酶的抑制作用强于熊果苷，其抑制机制均为竞争型抑制。Flemingia philippinensis roots[3]（蔓性千斤拔）用95%甲醇溶液提取获得最佳抑制效果（30μg/ml时抑制率为80%）的提取比例，用硅胶柱层析法分离出六种对酪氨酸酶有抑制作用的物质，三种是我们熟知的千斤拔素D,lupinifolin，khonklonginol H，另三种笔者命名为千斤拔素A、B、C，其中千斤拔素C最为有效，IC50值为1.28μM，是竞争型抑制。采用95%乙醇提取Morus nigra[4]的根，提取物用硅胶柱层析法分离出9种对酪氨酸酶抑制作用强于曲酸的物质，其中2,4,2',4'-tetrahydroxychalcone，morachalcone A效果最好，IC50为0.062和0.14μM。通过HPLC研究其分子构型，为后期研究构效关系提供了数据。Salleh[5]等人研究了马来西亚十种胡椒属植物，用乙酸乙酯提取，其中P.porphyrophyllum的提取物对蘑菇酪氨酸酶抑制作用最好，其主要成分为黄酮类，Salleh等人对P.porphyrophyllum的提取方式进行优化，发现其甲醇提取物对蘑菇酪氨酸酶抑制效果最好，抑制率为98%±0.3。在提取甘草酸后的甘草废渣[6]中发现了可抑制酪氨酸酶的有效物质—异甘草素和光甘草定。异甘草素为单酚抑制酶，IC50为1.66mmol·L-1；光甘草定对单酚酶和二酚酶均有抑制作用，IC50 分别为 31.16μmol·L-1，20.38μmol·L-1，其作用机制为竞争型抑制。

1.2 苷类

苷类，又称配糖苷，是糖或糖的衍生物与另一非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的化合物。

Huang[7]等人采取不同比例的乙醇溶液从crataegus pinnatifida种子提取的糖苷7R,8S-二氢脱氢二松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷和7R,8S-二氢脱氢二松伯醇-9'-O-β-D-葡萄糖苷对酪氨酸酶有明显的抑制效果，抑制率分别为58.15%和46.00%，乙醇溶液最佳比例为70%。Chang[8]等人以番茄萃取物为材料，得到其IC50为2.46mg/mL,通过Superdex peptide HR胶体管柱层析推测该抑制剂可能为糖苷类化合物。从红洋葱中提取的槲皮素4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷表现出较强的酪氨酸酶抑制作用，IC50值为 4.3μmol·L-1[9]。

1.3 醌类

醌是含有共轭环己二烯二酮或环己二烯二亚甲基结构的一类有机化合物的总称。采用甲醇溶液回流提取Anastatica hierochuntica[10]，HPLC分离的丹参酮（菲醌类），异丹参酮A和异丹参酮B可影响酪氨酸酶的mRMA表达，尤其是对TRP-2有较强的抑制作用，IC50在6.1—32μM之间。

1.4 苯丙素酚类

凡有一个或几个C6-C3单位构成，苯核上有酚羟基或烷氧基取代的天然芳香族成分都归为苯丙素酚类，包括苯丙烯，苯丙醇，苯丙酸及其缩酯，香豆素，黄酮类，木脂素和本质素类等。从白芷[18]，杜鹃花[19]，芦荟[20]中都分离出了香豆素的衍生物，均对酪氨酸酶有抑制作用。

1.5 萜类

萜类化合物是一类天然烃类化合物，由两个或两个以上异戊二烯分子聚合衍生而成。萜类化合物广泛存在于自然界，是构成某些植物的香精，树脂，色素等的主要成分，如玫瑰油，松脂等。从白术[21]中分离出了倍半萜化合物selina-4（14）,7（11）-dien-8-one，该化合物可以使黑色素细胞合成相关酶的表达量减少。

1.6 生物碱

生物碱是存在于生物界的一类含氮有机化合物，多数具有复杂的氮杂环结构、碱性和显著的生物活性。一般按生物碱化学结构的基本母核进行分类，例如吡啶类生物碱-苦参碱，异喹啉类生物碱-青藤碱，甾类生物碱-藜芦碱等。

Hui-Min Wang[11]等人用甲醇从Michelia alba提取的（-）-N-formylanonaine对蘑菇酪氨酸酶有抑制作用，IC50为 74.3μM。

2 评价方法

2.1 分光光度法

以L-酪氨酸或L-多巴作底物，以熊果苷或曲酸或维生素C做阳性对照，测定吸光度A，计算其半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。

2.2 光谱法

常用的光谱法包括紫外光谱分析，荧光光谱法，圆二色谱法。闫家凯[12]等人采用光谱法对夏枯草黄酮进行了研究，通过紫外光谱分析可知其为黄烷酮和双氢黄酮醇类化合物，荧光光谱显示夏枯草黄酮能显著的增强酪氨酸酶的疏水性，圆二色谱分析表明夏枯草黄酮诱导酪氨酸酶的构象发生了部分变化。

3 复方

Chun Liang等[13]将Silmax（菝葜）的甲醇提取物分别溶于己烷，乙酸乙酯和水中，其中乙酸乙酯提取物对酪氨酸酶抑制效果最好，由HPLC,C-NMR得到的结构数据显示提取物中氧化白藜芦醇效果优于薯蓣皂苷，其以酪氨酸酶和L-多巴为底物的阳性对照，IC50分别为7.8，10.9μg/mL，但两者的混合物可以达到更好的效果，混合物的IC50分别减小为5.1，5.7μg/mL。刘畅等[14]测定了20种植物醇提物对酪氨酸酶活性的抑制率。4种抑制效果好的植物分别为桑白皮、甘草、芙蓉花和牡丹花，并将4种抑制效果好的植物按不同配比进行组合，当配比为牡丹花3g，甘草2g，桑白皮3g和芙蓉花2g的组合醇提物在质量分数为1%时，对酪氨酸酶活性的抑制率可达93.04%。我国的中药方剂超过9万，其中不乏美白的方剂，对于已有的美白方剂研究也是十分有价值的，尤卓莹等[15]人通过均匀设计实验，分析得常规水提法所得的四物汤达到最佳美白作用的各成分质量比为m（当归）：m（川芎）：m（白芍）：m（熟地）=85：66：10：199。而通过逐步回归分析可知，四物汤在抑制酪氨酸酶的实验中存在交互作用，不应把四物汤中各味药分开提取研究其美白功效。

4 影响因素

通过对多数文献总结可知，多数提取物对酪氨酸酶抑制作用具有浓度相关性，因此会改变提取物浓度的提取因素均为影响提取物对酪氨酸酶抑制作用的因素，其中提取时间，提取的料液比，提取温度为主要限制因素。另外在分光光度法测定抑制率时，pH值也是影响因素之一。提取时还可以用超声波，提取液氮气加压超过滤等方法辅助。在对提取工艺进行优化时，可选择三因素三水平进行响应面优化试验。

5 研究方向讨论

酪氨酸酶抑制剂与皮肤美白、色素沉着等美容需求密切相关。因化学物的不安全因素，从植物中寻找酪氨酸酶抑制剂成为国内外研究热点。然而大自然给予我们的是千奇百怪的天然植物，如何更好地发现并安全有效的利用天然产物应当是我们研究的重点。我们认为酪氨酸酶抑制剂以后的研究方向更多的走向多种植物提取物的配伍，一是对于酪氨酸单酚酶和酪氨酸二酚酶的复合抑制，二是不同抑制机制的交互，三是不同植物提取物之间的协同作用。根据已知植物的有效成分可以进行筛选，例如，众所周知，多酚物质是一类重要的酪氨酸酶抑制剂，可通过清除活性氧、络合Cu2+和与底物竞争来发挥其抑制活性[16]，那么我们在筛选时应当注重含多酚的植物。对于未知有效成分植物的发现，更好地办法是建立有效的筛选机制，如刘艳杰等[17]的基于谱效-构效关系筛选大黄中酪氨酸酶活性抑制成分，由此我们可以试着建立类似先导化合物筛选的体系，利用计算机辅助药物分子对接评价，进行更加便捷的发现新的具有酪氨酸酶抑制作用的植物。这一课题符合绿色化学的理念，有巨大的市场前景，是值得研究的。

[1]Baurin N,Arnoult E,Scior T,etal.Preliminary Screening of some tropical plants for anti-tyrosinase activity[J].J.Ethaopharmacol.2002,82:155-158.

[2]N.Saewan,S.Koysomboon,K.Chantrapromma.Anti-tyrosinase and anti-cancer activities offlavonoids from Blumea balsamifera DC[J].Journal of Medicinal Plants Research2011,5(6):1018-1025.

[3]Yan Wang,Marcus J.Curtis-Long,Byong Won Lee,etal.Inhibition of tyrosinase activity by polyphenol compounds from flemingia philippinensis roots[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry,2014,22(3).

[4]Zong-Ping Zheng,Ka-Wing Cheng,Qin Zhu,etal.Tyrosinase Inhibitory Constituents from the Roots of Morus nigra:A Struture-Activity Relationship Study[J].Agric Food Chem,2010,58(9):5368-5373.

[5]Salleh WM,Hashim MA,Ahmad F,Heng Yen K.Anticholinesterase and antitryosinase activities of ten piper species from Malaysia[J].Advanced Pharmaceutical Bulletin,2014,4（2）:527-31.

[6]范玉涵，马全武，王建国，等.甘草废渣中有效成分对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].时珍国医国药，2013，24（11）：2649-2652.

[7]Xiao-Xiao Huang,Qing-Bo Liu,et al.Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Effects of Neolignan Glycosides from Crataegus pinnatifida Seeds[J].Planta Med,2014，80（18）：1732-1739.

[8]Lee-Wen Chang,Li-Chen Chang,Chit-Kwang Chiu,etal.Characterization of extract of Lycopersicon esculentum Mill.with anti-tyrosinse activity[J].Chia-nan AnnualBulletin,2010(36):79-86.

[9]Arung ET,Wijaya Kusuma I,Shimizu K,et al.Tyrosinase inhibitory effect of quercetion 4’-O-β-D-glucopyranoside from dried skin of red onion(Allium cepa)[J].Nat Prod Res,2011,25(3):256-263.

[10]Souichi Nakashima,Hisashi Matsuda,Yoshimi Oda,etal.Melanogenesis inhibitors from the desert plant Anastatica hierochuntica in B16 melanoma cell[J].Bioorganic&MedicinalChemistry.2010,18(6).

[11]Hui-Min Wang,Chung-Yi Chen,Chun-Yen Chen,etal.（-）-N-Formylanonaine from Michelia alba as a human tyrosinase inhibitor and antioxidant[J].Bioorganic&MedicinalChemistry,2010,18(74).

[12]闫家凯，张国文，周佳.光谱法研究夏枯草黄酮对酪氨酸酶的抑制作用[J].分析实验室,2013,32(2):17-21.

[13]Chun Liang,Ju-Hwan Lim,Seung-Hyung Kim,etal.Dioscin:A Synerg;tryosinase inhibitor from the roots of smilax china[J].Food chemistry,2012,134(12):1146-1148.

[14]刘畅，莫思颖，张怡，等.20种植物醇提物美白作用的体外测试[J].日用化学工业，2013，43（6）：450-452+462.

[15]尤卓莹,何秋星，李馨恩，等.四物汤美白功效评价及其药效关系研究[J].日用化学工业，2015，45（1）：45-48.

[16]CHANGTS.An updated review of yrosinase inhibitors [J].International Journal of Molecular Sciences，2009，10(6):2440-2475.

[17]刘艳杰，王倩，姜民，等.基于谱效-构效关系筛选大黄中酪氨酸酶活性抑制成分的方法研究[J].中草药，2012，43（11）：2120-2126.

[18]Piao XL,Baek SH,Park MK,et al.Tyrosinase inhibitory Furanocoumarin from Angelica dahurica[J].Biol Pharm Bull,2004,27(7):1144-1146.

[19]Ahmad VU,Ullah F,Hussain J,et al.Tyrosinase inhibitors from Rhododendron collettianum and their structure-activity relationship(SAR)studies[J].Chem Pharm Bull,2004，52(12):1458-1461.

[20]Tan C,Zhu W,Lu Y.Aloin,cinnamic acid and sophorcarpidineare potent inhibitors of tyrosinase[J].Chin Med J(Engl),2002,115(12):1859-1862.

[21]Chang YH,Kim C,Jung M,etal.Inhibition of melanogenesis by selina-4(14），7(11)-dien-8-one isolated from atractylodis rhizoma alba[J].Biol Pharm Bull,2007,30(4):719-723.