甲壳动物RNAi技术研究与应用进展

邱锡尔 朱冬发 周彦琦 柳志业 谢熙

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

甲壳动物RNAi技术研究与应用进展

邱锡尔 朱冬发 周彦琦 柳志业 谢熙

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的一种使特定基因沉默的现象。作为一种研究基因功能、发现新基因和抗病毒的新型手段，近年来RNAi技术在昆虫、真菌、植物和哺乳动物等的研究中已被广泛应用，但是在甲壳动物研究中尚处于起步阶段。对甲壳动物RNAi技术实施方法做了简要介绍；着重综述了RNAi技术在甲壳动物CHH家族神经肽类基因功能、蜕皮和生长调控机制、配子及性腺发育调控和甲壳动物抗病毒机制研究上的应用进展。

RNAi；甲壳动物；基因功能；抗病毒

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指由内源或外源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发转录后相应mRNA水平下降，是一种转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。自Fire等［2］在1998年提出RNAi概念，并在2006获得诺贝尔奖至今，RNAi技术已成为一种研究基因功能、调控机制、发现新基因、抗病毒和传染病治疗的有效新方法，在昆虫、真菌、植物、哺乳动物等生物中获得广泛应用［3-5］。

虾蟹类等甲壳动物具有很高的经济价值，研究其功能基因的调控机制和抗病毒机制等对于开发甲壳动物资源具有深远意义，但是直到2005年才有文献描述RNAi技术在甲壳动物研究上的应用［6，7］。本文对甲壳动物RNAi技术实施方法做简要介绍，并着重综述RNAi技术在甲壳动物CHH家族神经肽类基因功能、蜕皮和生长调控机制、配子及性腺发育调控和甲壳动物抗病毒机制研究上的应用进展。

1 甲壳动物RNAi的实施方法

1.1 注射法

注射法是实验室研究甲壳动物RNAi最常用技术，一般将dsRNA或siRNA直接注射到甲壳动物血淋巴、肌肉（局部组织）或卵粒中，使dsRNA或siRNA迅速到达靶组织，该方法干扰效率最高［8］。目前制备dsRNA 的方法主要有体外转录和载体构建表达。体外转录法用RNA聚合酶转录合成单链的RNA，再互补成dsRNA；体内载体表达通过构建质粒，在细菌内表达获得大量dsRNA［8，9］。siRNA 的设计和筛选较dsRNA较为繁琐，目前合成siRNA 的方法包括体外转录、Dicer 酶切割、PCR 扩增和质粒或病毒表达siRNA等［10］。已证明注射siRNA也能有效引起基因沉默。例如，给斑节对虾（Penaeus monodon）和日本囊对虾（Marsupenaeus Japonicus）注射siRNA均能够引发抗白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）作用［10，11］。

1.2 离体培养法

由于甲壳动物缺乏研究用的细胞系或细胞株，一般直接采用动物组织与双链RNA进行离体培养。例如，研究者解剖获取活体斑节对虾的眼柄神经节（剪碎成0.8-1 cm），在M199培养液中加入100 μg/mL青霉素，于24孔培养板在20-24℃条件下震荡培养3 h和6 h，每孔加入1.5 mL 培养液。同一只对虾左侧眼柄用于阴性对照，与非特异性绿色荧光蛋白双链RNA（dsGFP）共同培养作为对照组；右侧眼柄分别与3 μg GIH dsRNA共同培养作为实验组。半定量结果显示实验组GIH表达量下降［12］。

1.3 饲喂法

昆虫RNAi试验多用饲喂法［13］，而甲壳动物受生活环境所限制，饲喂法基因沉默的效率远低于注射法。但是注射法耗时耗力，对试验动物造成一定伤害；且单次注射的dsRNA 数量有限。若能解决饲喂手段诱导RNAi效率不高的问题，有希望应用于大型商业养殖中，实现甲壳动物生长发育的人工调控和抗病毒防治。Treerattrakool等［14］通过制备能够高效表达GIH dsRNA的大肠杆菌E. coli，以成体丰年虫为中间载体喂食给斑节对虾，但RNAi效果明显不如注射法，有待进一步完善。

2 甲壳动物RNAi技术的应用

2.1 CHH家族神经肽基因功能的研究

甲壳动物眼柄中的X-器窦腺复合体（X-organsinus gland，XO-SG）合成并分泌甲壳动物高血糖激素家族（crustacean hyplyeemic hormone family，CHH家族）激素，包括高血糖激素（crustacean hyperglyeemie hormone，CHH）、蜕皮抑制激素（molt-inhibiting hormone，MIH）、性腺抑制激素（gonad/vitellogenesis-inhibiting hormone，GIH/VIH）等肽类激素，这些激素统称为CHH家族神经肽，调控甲壳动物糖类代谢、蜕皮、繁殖等生理生化过程［15，16］。

2.1.1 高血糖激素CHH CHH肽类激素主要功能是调控甲壳动物体内的血糖水平，维持能量供应［17］。2006年，Lugo等［18］将CHH dsRNA注射到南方滨对虾（Litopenaeus schmitti）的腹部血淋巴，结果发现在24 h 内CHH表达和相应血淋巴中的血糖浓度均下降，验证了CHH具有使血糖升高的功能，也说明RNAi技术在甲壳动物上应用的可行性。

2.1.2 蜕皮抑制激素MIH 甲壳动物的蜕皮过程主要由MIH与Y器分泌的蜕皮激素通过拮抗作用来调节［19］。Tiu等［20］以雌性刀额新对虾（Metapenaeus ensis）为研究对象，注射MeMIH-B dsRNA后发现胸腺神经节和眼柄组织中的MeMIH表达水平下降，且肝胰腺和卵巢组织中卵黄蛋白（vitellogenin，Vg）基因的表达也随之下降，证明MeMIH除了抑制蜕皮外，很可能还具有促进性腺发育的功能。向红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）注射MIH dsRNA可以促进其蜕皮的发生［21］。这些研究结果验证了MIH激素是调控甲壳动物蜕皮的关键因子，还很有可能参与卵巢发育的调控。

2.1.3 性腺抑制激素GIH/VIH GIH/VIH是调控甲壳动物性腺发育的主要激素［22］。Treerattrakool等［12］在2008年将GIH dsRNA与斑节对虾组织进行离体培养试验后发现，雌性对虾眼柄和腹部神经节组织中GIH表达水平降低；将GIH dsRNA注射雌性对虾体内，结果显示卵巢中的Vg表达水平显著上升，说明GIH对Vg具有明显的抑制作用。切除眼柄可以促进克氏原螯虾（P. clarkii）和日本囊对虾等多种甲壳动物的亲本卵巢成熟［23，24］，Treerattrakool等［25］在2011年的研究进一步说明RNAi技术可以替代传统的单侧眼柄切除，有效抑制GIH表达，从而促进卵巢成熟和排卵。随后，Treerattrakool等［14］尝试利用饲喂法替代dsRNA注射法，结果显示GIH表达水平有明显下降，但是与注射法结果相比，诱导基因沉默的效果仍有较大差距。以上研究结果表明GIH激素很有可能是通过抑制卵黄蛋白原Vg的生成来调节甲壳动物性腺发育。

2.2 甲壳动物蜕皮和生长调控机制的研究

维甲酸类X受体（retinoid X receptor，RXR）已证明与甲壳动物蜕皮、代谢调节、附肢再生等多种生理生化过程相关［26，27］。RXR通过与蜕皮激素受体（ecdysone receptor，EcR）形成二聚体复合物EcR /RXR，再与蜕皮激素应答元件结合，调控下游基因E75等转录，从而调节相关生理过程［28］；也有研究显示RXR可能是甲壳动物激素MF的受体［29］。

Priya等［30］向中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）体内注射RXR dsRNA，干扰效应在48 h达到高峰，且RXR调控的下游基因FcE75和两种几丁质酶（chitinase）基因FcChi和FcChi-1表达水平均显著下降。研究已证明，甲壳动物几丁质酶能够降解外骨骼中的几丁质，其水解产物会重新进入到新表皮的合成中，且几丁质酶受到蜕皮激素调控，与蜕皮密切相关［31］。说明RXR参与了甲壳动物的蜕皮激素信号通路、调控下游基因E75和几丁质酶基因的转录表达［31，32］。随后Priya等［33］为进一步研究E75的功能，通过持续注射FcE75 dsRNA诱导E75沉默，阻碍中国对虾蜕皮的发生并最终导致试验对象死亡，结果说明E75很可能与蜕皮调控密切相关且是中国对虾生长所必须的基因。

甲基法尼酯（methyl farnesoate，MF）是一种类倍半萜烯激素，是甲壳动物体内一种重要的内分泌调控激素，与生长繁育、形态建成、蜕皮、渗透压调节等多种生理过程有关［34-37］。FAMeT是MF合成路线中最后阶段的关键酶，Hui等［38］为研究FAMeT的功能，向凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）注射LvFAMeT dsRNA，检测到眼柄中FAMeT表达水平明显下降，与蜕皮有关的组织蛋白酶-L（cathepsin-L，LvCat-L）和血蓝蛋白（hemocyanin，LvHemo）表达受到影响，试验对象蜕皮失败并最终死亡。研究者推测FAMeT在MF合成中具有不可替代的作用，LvFAMeT的沉默使MF合成受到阻碍，从而导致实验对象的生理调控无法正常进行。该研究结果显示FAMeT在凡纳滨对虾的蜕皮调控和生长发育中起到了重要作用。

已有报道RXR与甲壳动物附肢再生有关［26，27］。Das等［39］先后切除招潮蟹（Uca pugilator）眼柄和三条步行足、大螯，等待其完全自切残肢后，在大螯和第三步行足基部早期附肢芽膜内注射EcR dsRNA和RXR dsRNA混合物。结果显示，招潮蟹再生附肢的生长速度和形态均受到明显影响，EcR与RXR表达水平显著下降。通过显微镜切片观察发现，试验对象再生附肢的表皮生长不良；细胞增殖试验发现这些再生失败的附肢芽中几乎不存在分裂细胞；且蜕皮酮类激素水平下降，未注射部位附肢也无法正常再生，说明该RNAi实验并不单是在局部起作用，而是能够引发系统性基因沉默（systemic gene silencing）。长期观察发现实验对象多数蜕皮失败或死亡，说明RNAi实验对生物体具长期影响。

2.3 甲壳动物配子发生和性腺发育调控机制研究

甲壳动物的促雄腺（androgenic gland，AG），又称造雄腺、促雄性腺，只存在于雄性个体中，其功能与甲壳动物性腺发育和性别分化有密切关系［40］。研究证明，破坏AG对中国对虾雄性第二特征发育产生抑制作用，影响交接器生长；切除和移植AG能诱导多种甲壳动物性反转的发生［41-43］。Rosen等［44］发现促雄腺特异性类胰岛素（AG specific insulin-like，IAG）基因在红螯螯虾的促雄腺 cDNA消减文库中具高效表达，说明可能与AG的特殊生理功能有关。研究者注射IAG dsRNA来研究该基因的功能［45］，雄性试验幼体出现雌性性征，精子数量减少，精巢开始退化；促雄腺细胞过度膨大，可能是体内雄性激素水平低下的反馈作用所导致。说明IAG与红螯螯虾雄激素生成有关，其性腺的发育可能依赖于该类基因的调控。马文明等［46］发现注射促雄腺提取物会抑制雌性罗氏沼虾卵巢发育，显微观察无卵母细胞；将促雄腺激素类似物的dsRNA通过心脏注射到性腺发育成熟雄性个体后，检测到壶腹中MAL表达量显著下降，但是对实验体表型未产生明显的影响，推测RNAi不容易使性腺发育成熟的沼虾发生第二性征退化或性反转。

Kazal型蛋白酶抑制剂（KPI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，MRPINK是一种具有两个Kazal型结构域的蛋白酶抑制剂。在罗氏沼虾中MRPINK可以特异性地抑制精子明胶酶（MSG）的活性，然而MSG在罗氏沼虾生殖过程中的生理功能尚不明确。钱叶青等［47］利用RNAi技术进一步研究MSG在受精过程中的功能，将MSG dsRNA注射到成熟雄性罗氏沼虾体内。结果表明，发生MSG沉默的罗氏沼虾精子在形态上未异常，但是精子的明胶水解活性下降，与对照组相比无法形成降解圈，说明经RNAi后的精子在体外存在一定的功能缺陷。随后发现试验雄虾与正常雌虾交配受精能正常进行，推测MSG在精子的蛋白水解活性方面存在重要作用，且雌虾可能会分泌某些物质来弥补MSG功能缺失。

卵黄磷蛋白是一种高密度糖脂蛋白，是所有卵生动物卵黄的主要成分及胚胎和幼体早期发育主要的营养来源。卵黄蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黄蛋白的前体。卵黄蛋白原的合成和积累对于雌性个体卵母细胞的发育和卵子的数量和质量密切相关，但是Vg的合成部位尚存在争议。据现有研究显示，甲壳动物的Vg合成分为内源性和外源性两种，外源性合成是指卵黄蛋白在卵母细胞以外的部位合成后通过血淋巴运输到卵巢［48，49］。Tiu等［50］以斑节对虾为研究对象注射VgR dsRNA来沉默卵黄蛋白原受体（vitellogenin receptor，VgR）基因，检测结果发现雌虾卵巢中VgR蛋白含量减少，相反在血淋巴中Vg水平上升。所以该项研究结果说明斑节对虾的Vg合成很可能通过外源性而来，其VgR很可能是游离存在于血淋巴中，与肝胰腺等部位合成的卵黄蛋白结合后运输到卵巢中的卵母细胞内。

RXR在脊椎动物的繁殖过程中起到重要作用［51］，但是 RXR在甲壳动物繁殖中的具体功能尚不明确。Nagaraju等［52］发现在普通滨蟹（Carcinus maenas）的卵黄发育不同阶段，肝胰腺中RXR表达水平有显著上升，卵巢中RXR表达水平只在第三阶段略有上升，说明RXR与卵巢发育有关。离体培养结果显示在与MF共同培养的肝胰腺和卵巢组织中，RXR和Vg表达水平比对照组显著上升。体内注射RXR dsRNA后，RXR和Vg表达水平均下降，血淋巴中MF含量也随之下降。以上结果说明普通滨蟹RXR可能直接参与或与MF共同调控卵巢发育过程。

2.4 甲壳动物抗病毒机制的研究

已证实RNAi在线虫、果蝇、蚊和植物等生物中是一种天然的抗病毒机制［5，13］，所以在甲壳动物中RNAi很可能是一种对抗病毒的新型技术手段。RNAi技术通过干扰特定的病毒基因，阻碍病毒复制，提高实验对象存活率。根据现有的研究，一般认为注射病毒特异性siRNA、dsRNA会明显抑制病毒的繁殖，注射非特异性siRNA、dsRNA可以诱发甲壳动物体内先天抗病毒免疫机制的发生，但是抗病毒效果不如特异性双链RNA，且目前对虾类研究较多。例如，Tirasophon等［53］发现在斑节对虾体内注射dsRNA能诱导抗黄头病毒（yellow head virus，YHV）的发生，且病毒特异性dsRNA诱导产生的抗病毒效果要好于非特异dsRNA。VP15和VP28分别是病毒的一种核衣壳蛋白和囊膜蛋白，在病毒增殖过程中具有潜在的重要功能。张衡等［54］分别将vp15 基因的特异性dsRNA（vp15-dsRNA）和非特异性dsRNA（gfp-dsRNA）与WSSA病毒共同注射到克氏原螯虾（P. clarkia）体内，结果显示vp15-dsRNA能特异性敲除vp15 的转录表达，有效抑制了WSSV病毒粒子的增值，进一步揭示vp15蛋白在WSSV增殖以及在病毒装配过程中的重要性。Westenberg等［55］发现给斑节对虾注射病毒VPl5、VP28特异性siRNA和非特异性的siRNA（绿色荧光蛋白GFP）均能引发特异的抗WSSV作用，但是后者的抗病毒作用不如特异性siRNA显著。斑节对虾抗菌肽penaeidin5（PenmonPEN5）可能是一种病毒应答基因，为研究其具体的功能，Woramongkolchai等［56］发现PenmonPEN5在斑节对虾血细胞中表达量最高；预先在斑节对虾体内注射PenmonPEN5 dsRNA，对照组注射poly（GC）或NaCl 溶液，随后分别将WSSV病毒与PenmonPEN5 dsRNA，poly（GC）或NaCl共同注射，实验组对虾血细胞中VP28表达显著上升，说明PenmonPEN5在斑节对虾抗病毒机制中具有重要作用。整合蛋白（integrin）是细胞黏附受体超家族的成员，已证明可能在细胞吞噬和附着中具有重要重用，也可以促进细胞增殖和生存。Lin等［57］发现integrinβ几乎在凡纳滨对虾所有组织中表达，在血细胞中表达量特别高；注射integrin β dsRNA后，发现integrinβ发生沉默，对虾体内透明细胞、颗粒细胞数目，血细胞计数和溶菌酶等活性下降，说明integrin β参与凡纳滨对虾的细胞吞噬过程，在对虾的免疫防御机制中具有重要地位。这些研究结果对于深入了解甲壳动物病毒防治具有重要的意义。

但也有研究显示非特异性双链RNA对于抗病毒并无明显作用。肖瑾［58］用siRNA、dsRNA和几种免疫刺激物，注射到凡纳滨对虾体内，研究其引发的RNAi作用以及非特异性dsRNA可能引起的先天免疫反应发现，特异性的siRNA能显著的降低目的基因的表达量和对虾白斑综合症病毒（WSSV）的扩增速度，在一定程度上能延缓对虾的死亡时间，效果随着注射量的增加而加强；而非特异性的siRNA对于抗WSSV并无作用。Tirasophon等［59］向感染黄头病毒YHV 的斑节对虾注射YHV蛋白特异性dsRNA发现，病毒的复制被明显抑制，但注射非特异性GFP dsRNA 不能抑制病毒复制，说明只有病毒特异性序列才能诱导RNAi的发生。这些研究结果说明非特异性双链RNA能否诱导RNAi或甲壳动物体内先天免疫机制的发生可能存在物种差异性，需要进一步的研究来探讨。

3 展望

目前，RNAi在甲壳动物的相关研究中有了越来越广泛的应用。RNAi作为一种新型技术可以通过dsRNA高效抑制或阻断特异性靶基因表达，代替了传统的眼柄或组织切除手术，有效减少实验体的损伤并提高实验对象的存活率。该技术很可能在今后作为甲壳动物研究的一个突破口，在新基因的发现、基因功能的研究、信号转导通路的阐明中发挥重大作用。由于甲壳动物体内只有非序列特异性的先天免疫防御应答，缺少脊椎动物的获得性免疫应答反应，且目前对甲壳动物的病毒防御机制尚未研究透彻，在养殖业中（特别是对虾养殖）缺乏有效的防治病毒的技术手段。所以RNAi被认为是一种具有广阔实用前景的新型抗病毒技术，未来可能在甲壳动物养殖业的抗病毒中发挥重要作用。虽然近几年的研究已经表明特异性双链RNA对于抗病毒具有明显作用，但是基本采用直接注射的方法。注射法高效诱导特异性RNAi的发生，但每次注射体积有限，若要大批量应用或持续注射，会耗费大量时间和人力。若能在今后建立一个有效的饲喂方式，通过简单的喂食将双链RNA导入试验对象体内，或是能在甲壳动物体内构建一种长期性表达病毒特异性双链RNA的体系，有望大批量用于实践养殖中，促进甲壳动物的研究和经济虾蟹类物种的养殖业发展。

此外，由于甲壳动物方面的RNAi研究基础相对较为薄弱且研究物种较单一，目前缺乏体外培养用细胞系。为了今后甲壳动物的分子研究、抗病毒和资源利用的进一步发展，有必要尽快开展细胞培养研究和建立甲壳动物细胞系。

综上所述，随着对甲壳动物RNAi 研究的不断深入，相信RNAi技术将在甲壳动物的功能基因组学、基因表达调控机制及信号传导通路、病毒防治等方面发挥重要的作用，大力推动甲壳动物研究进展。

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（责任编辑 狄艳红）

Progress of Research and Application of the RNA Interference Technology in Crustacean

Qiu Xier Zhu Dongfa Zhou Yanqi Liu Zhiye Xie Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

RNA interference（RNAi）is a phenomenon that the gene is post-transcriptionally inhibited by using specific double-stranded RNA（dsRNA）， gene silencing will be happened eventually. As a new technology， RNAi contributes to the understanding of the the functions and mechanisms of genes. RNAi is widely used in insects， fungus， plants and mammals， however， the reseachs on the crustacean are relatively less than the former. This review highlights the advancements of RNAi in crustaceans， including the study of methods， gene functions about CHH family， mechanisms of molting and gonadal regulation. In addition， RNAi plays an important role in an antiviral defense in crustacean.

RNA interference；crustacean；gene function；antiviral defense

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.008

2014-06-06

国家自然科学基金项目（41376152），浙江省自然科学基金项目（LY13C190006）

邱锡尔，女，硕士研究生，研究方向：甲壳动物发育生物学；E-mail：qxe2013@yeah.net

朱冬发，男，教授，研究方向：发育生物学和遗传育种学；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn