SSR分子标记在烟草研究中的应用进展

陈杰杨静龙胜贤肖慈平杨昌义黄清忠王维

（1.贵州省黔东南州烟草公司，凯里 556000；2. 华南农业大学农学院 华南农业大学烟草研究室，广州 510642）

SSR分子标记在烟草研究中的应用进展

陈杰1杨静1龙胜贤1肖慈平1杨昌义1黄清忠1王维2

（1.贵州省黔东南州烟草公司，凯里 556000；2. 华南农业大学农学院 华南农业大学烟草研究室，广州 510642）

SSR分子标记技术作为最常用的分子标记技术之一，该标记技术重复性好，结果可靠，近年来在烟草遗传育种中展示了广阔的应用前景，是应用潜力较大的分子标记技术。介绍了SSR分子标记的原理及其分布特征，对其在烟草基因定位及分子标记辅助选择、种质资源研究、遗传图谱构建及种子纯度及真伪鉴定研究中的应用等方面进行了综述，并探讨了SSR分子标记技术在烟草遗传育种中的应用前景，以期为烟草SSR分子标记技术的研究提供参考。

烟草；分子标记；SSR；遗传育种

在生物个体间，最本质的差异是DNA分子水平间的差异，DNA分子标记技术是对遗传物质本身差异的直接检测，能准确地反映动植物遗传组成全貌，因此DNA是最为可靠的遗传标记。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织甚至器官作检测，其具有数量丰富、涉及全基因组、遗传稳定、多态性高、不受外界环境影响、无上位性作用等一系列显著优点［1］，DNA分子标记技术自诞生之日起，就引起了生物科学家们极大的兴趣。自1974年，Grozdicker等［2］利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体，首创了DNA分子标记技术以来，DNA分子标记技术日趋成熟、完善［3］。目前最常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR 等。与其他几种常用的分子标记技术相比，SSR标记具有信息量更高、多等位点、共显性、稳定可靠及操作简便等显著优点，在基础理论研究和实际应用等方面取得了巨大的成绩，广泛地应用于遗传育种、物种亲缘关系鉴别、基因组作图、基因定位、基因库构建和基因克隆等方面。

1 SSR分子标记技术的原理和特点

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），又称微卫星DNA（micro-satellite DNA），是指以少数几个核苷酸（1-6个）为单位多次串联重复的DNA序列，重复次数一般为10-50，亦称简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，从而获知不同个体在某个SSR座位上的多态性。

这种重复序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成，保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。近年来，SSR分子标记技术成为种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛地应用于种群遗传多样性分析、基因定位及分子标记辅助选择、遗传连锁图谱的构建［4］。与其他作物相比，烟草SSR标记开发研究起步较晚。近年来，随着烟草基因组计划取得的巨大成就，SSR分子标记技术在烟草遗传育种中运用越来越广泛及深入。

2 烟草EST-SSR分布特征

随着分子生物学技术的高速发展，植物表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）得到大量测定，EST数据的快速增长为SSR标记的开发提供了丰富的序列资源，使得基于EST序列进行SSR标记开发的能力大大增强。

王卫锋等［5］通过对绒毛状烟草基因组中SSR位点的信息分析发现，A/T碱基出现的频率显著高于G/C，二、三碱基重复基元的SSR占SSR总体的94.8%，出现频率最高。而（CG）n、（GTG）n、（GTC）n、（GCA）n、（CGC）n这些重复单元的SSR在绒毛状烟草基因组中非常少见，分别只出现了1次，得出烟草SSR序列显示出显著的碱基偏好性的结论。薛金爱等［6］对GenBank上公布的158 098条EST序列及10 647条GSS序列进行大规模微卫星位点搜索，在EST和GSS中搜索到的重复单元中二核苷酸发生的次数最多，在EST中TC发生的频率最高，在GSS中出现最多的是TA；其次是三核苷酸，其中发生次数最多的分别是TGA和CAA。李绪英等［7］对烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的SSR信息进行了分析，分别获得186和578个SSR位点，且这些SSR重复碱基类型绝大部分为二、三碱基重复。

在大多数植物中，EST-SSR分布以二、三核苷酸重复类型为主，而且在二核苷酸重复的EST-SSRs中，含AG/TC的重复单元最多，烟草EST-SSR的分布特征与其他大多数植物基本一致［8-15］。

3 SSR标记在烟草遗传育种中的应用

3.1 基因定位及分子标记辅助选择

传统的烟草育种主要依赖于植株表型选择和抗性鉴定，要求育种者须有丰富的经验，育种周期也较长，且极易受到病虫害发生状况及气候条件的限制，导致鉴定结果出现偏差，甚至造成优良抗性基因的丢失，选择效率较低［16，17］。因此，如何快速选育抗病优质烟草新品种是广大烟草育种工作者面临的主要问题之一。分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，MAS）利用与目标性状相连锁的分子标记可以对育种材料从DNA水平上进行高效选择，从而对作物产量、品质和抗性等性状进行改良，同时因其不受基因效应和环境因素的影响，选择结果可靠性比较高，从而解决了育种年限长的问题，大大提高育种进程［17］。SSR分子标记辅助选择近年来在烟草上得到了越来越多的应用。

范静苑、文轲等［18，19］利用抗CMV的烤烟品种台烟8号构建分离群体进行遗传分析，分别筛选到一个与抗性基因相关的SSR标记，并探讨了烟草CMV的抗性遗传规律，认为台烟8号对CMV的抗性由多基因控制。同时范静苑等还筛选到一个与来源于铁把子的与CMV抗性基因相关的SSR标记。吴海乔［20］利用1 152对SSR标记对烟草青枯病抗病品种岩烟97与感病品种红花大金元构建的F2群体进行分析，筛选出4个在抗、感池间表现差异的标记。范江等［21］以抗青枯病的烟草品种‘Oxford207'与感病品种红花大金元为亲本构建群体，从800多条SSR引物中筛选出3个在抗感池之间有多态性的引物，并得出来自‘Oxford207'的青枯病抗性基因属于加性基因控制的结论。蒋彩虹等［22］在筛选到的一个与净叶黄抗赤星病基因的遗传距离为9.37 cM标记的基础上，在该标记的两侧10 cM范围内分别选择15对SSR引物对抗病亲本净叶黄与感病亲本NC82的杂交F2进行SSR标记分析，筛选到一个与来源于净叶黄的赤星病抗性基因间的遗传距离为4 cM的标记。牟建英等［23］从2 317对SSR引物中筛选得到61对多态稳定的引物，用其对台烟7号（♀）×NC89（♂）构建的285株F2群体进行分析，检测到1个与烟草白粉病抗性基因紧密连锁的SSR标记。

分子标记辅助选择育种的关键是寻找与目的基因紧密连锁的分子标记，两者连锁越紧密，则标记与目的基因的重组率越低，选择效率也就越高。分子标记辅助选择将现代分子生物学与传统育种学结合，为植物育种工作提供不受环境影响、可量化的标准方法，使作物遗传育种进入了一个崭新的阶段。近年来，利用SSR分子标记辅助选择技术已在水稻、小麦、玉米、棉花和番茄等作物的抗病性育种中取得了巨大的成就，并且通过分子标记辅助选择技术将多个抗病基因进行有效聚合，培育出广谱抗性持久、稳定的品种，解决了利用转基因技术进行抗性育种耗时、成本昂贵，基因沉默、遗传不够稳定及安全性等问题［24-29］。然而，分子标记辅助选择聚合育种在烟草育种中还未见相关报道，这主要可能是由于目前在烟草的抗性基因定位中还没有找到一个与目的基因紧密连锁的标记造成的。

3.2 烟草分类及遗传多样性研究

DNA多样性是遗传多样性的本质，种质资源遗传多样性的发展经历了形态学标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）、生物化学标记（biochemical markers）和分子标记（molecular markers）4个主要阶段。由于分子标记技术不受环境、季节的影响，与其他遗传标记相比，更适合用于动、植物分类和遗传多样性研究。刘胜传、叶兰钦和李文平等［30-32］分别应用SSR分子标记技术分析了部分烟草种质的遗传多样性，都得出了烟草品种间遗传差异较小的结论。聂琼等［33］利用从番茄、辣椒的SSR引物中筛选出8对重复性好、多态性高的同源性SSR引物对24份烤烟材料进行遗传差异性分析得出，同科植物的SSR引物也能够较好地揭示烟草种质资源遗传背景和亲缘关系，可应用于烟草品种资源的遗传差异分析的结论。徐军等［34］利用SSR标记构建了80份普通烟草种质的指纹图谱。王曼等［35］利用10对SSR引物对吉林省11份晒烟种质和2份烤烟种质进行遗传多样性与亲缘关系进行分析，得出不同烟草类型种间遗传差异明显，而种内遗传基础相对狭窄的结论。黄莉莎等［36］从62对SSR引物中筛选出21对多态性高、稳定性好的核心引物对9份烟草主栽品种进行DNA指纹图谱构建，发现9个品种间遗传关系较近。杨柳等［37］利用14对多态性好、条带清晰的烟草SSR引物，对25份烟草种质资源亲缘关系进行分析，其研究认为25份普通烟草种质间的遗传差异与其品种特性、调制类型、地理来源的差异没有必然联系，但较好地反映了烟草种质间亲缘关系。

遗传多样性不仅反映出物种变异水平的高低，而且能体现变异的分布格局，准确反映物种的血缘关系、育种背景和利用价值，对优质种质资源的保护、育种潜力的发掘利用、杂交种的选配、育种效率的提高具有重要意义［38，39］。对烟草种质资源亲缘关系的研究表明，我国烟草品种间遗传距离较窄，烟草育种工作面临亲本匮乏，主体亲本使用过度、重复性大等问题，因此在今后的育种工作中要积极引入外源基因，加大优质野生种质资源的利用，拓宽种质的遗传基础［40，41］。

3.3 遗传图谱的构建及种子纯度和真伪鉴定

拥有一张高密度分子标记遗传图谱是开展分子标记辅助选择以及基因定位工作的基础，1978年Donis-Keller等［42］首次利用RFLP标记构建了人类的第一张基因连锁图谱，从此DNA分子标记技术就开始广泛地应用于各种动、植物遗传图谱的构建中。目前，在水稻、小麦、玉米和番茄等作物中已经拥有了高密度甚至饱和的遗传连锁图谱［43-46］。近年来，随着SSR分子标记的大量开发，SSR分子标记技术越来越多地应用到烟草遗传连锁图谱的绘制。

2001年，Lin等［47］利用RFLP标记技术构建了第一张烟草分子标记遗传连锁图谱。肖柄光等［48］以烤烟品种杂交得到的137个DH系为作图群体，利用ISSR和RAPD标记的遗传连锁分析构建了包括27个连锁群在内的国内外第一张烤烟分子标记遗传连锁图谱。Bindler等［49］利用Hicks Broad Leaf和Red Russian杂交产生的186个F2单株作为作图群体，构建了第一张烟草SSR标记遗传连锁图，之后Bindler等［50］在2007年工作的基础上，利用已经公开发表的1379 067个烟草原始基因序列（GSS）和55 411个表达序列（ESTs）设计出5 500个SSR引物，从这5 500个引物中筛选出2 317个多态性、重复性好，条带清晰的SSR标记，利用Hicks Broad Leaf和Red Russian杂交产生的186个F2单株作为作图群体，构建了包括2317个SSR标记，2 363个位点在内的24个连锁群，总遗传长度为3 267 cM，标记间的平均距离小于1.5 cM。这是目前包含标记位点最广、标记密度最大、平均图距最小的烟草分子连锁图谱。

随着我国烟草育种研究的不断深入，越来越多的优良、抗逆性强的品种被选育和引进，为解决我国烟草品种单一问题提供了有力的支撑，然而同时也增大了品种混杂的可能性。烟草种子纯度和真实性是优良品种生产的保证。建立快速、准确的烟草种子纯度鉴定技术是对规范我国烟草种子市场和促进我国烟草产业发展的迫切需要。随着科技进步，分子标记技术已经开始用于作物种子纯度的鉴定。利用SSR标记技术构建指纹图谱鉴定种子纯度和真伪在水稻、玉米、棉花和油菜［51-54］等作物中具有较多的研究，但在烟草种子方面的应用很少有文献报道。

总体上，烟草分子标记遗传图谱构建及在种子纯度和真伪鉴定等研究中的应用程度远远落后于其他作物，这可能是由于栽培种烟草属于异源四倍体，有48条染色体，全长约4 600 Mb，约为人类基因组全长的1.5倍，基因组巨大和分子标记在烟草中开发利用较少造成的［55］。

4 前景

加强作物育种，必须加大对分子育种技术的应用。近年来，育种学家对利用分子生物学手段进行作物育种表现出浓厚的热情，但目前烟草SSR标记的开发远远落后于其他作物。烟草染色体数目较多，基因组庞大，包含大量的重复序列，这给烟草基因组物理图谱的构建和测序造成了极大的困难。因此到目前为止可利用的分子标记数量也十分有限，难以构建高密度的烟草遗传连锁图谱，无法筛选到与目标基因紧密连锁的分子标记。将与目标基因连锁的分子标记运用于遗传育种的早期辅助选择，仍停留在基础理论研究阶段，目前还没有通过有利基因聚合的分子育种烟草产品的报道［56］，尤其是在烟草抗旱、耐寒、抗早花基因筛选方面缺乏相关研究。近年来，烟草单染色体分离扩增技术在烟草中开始有研究，对于烟草这类大基因组的物种而言，构建高覆盖率的单染色体文库能够解决高密度烟草遗传图谱的绘制和烟草基因组测序的难题［57］。

目前烟草基因组计划（TGI）已取得巨大进展，近几年各国启动的烟草基因组计划将烟草基础研究推向了高潮。据报道，我国现已成功完成绒毛状烟草与林烟草全基因组序列图谱，这是全球第一套烟草全基因组序列（http：//scitech.people.com. cn/GB/16572602.html）。同时基因比较作图研究也成为国际研究热点，SSR标记同源性、通用性的研究也在烟草中展开［58，59］。这些技术的发展及取得的成果为烟草ESTs数量迅速增加、SSR标记的开发和高密度的分子连锁图谱的构建提供重要的依据，为获得与目标基因紧密连锁的分子标记、基因的精确定位、分子标记辅助选择提供重要前提，从而达到简化传统育种方法的目的。在未来，利用SSR分子标记技术开展烟草分子设计育种一定会成为烟草育种的热点。

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（责任编辑 狄艳红）

Advance of the Application of SSR Molecular Markers in Tobacco Research

Chen Jie1Yang Jing2Long Shengxian1Xiao Ciping1Yang Changyi1Huang Qingzhong1Wang Wei2
（1. Qiandong-nan Tobacco Company in Guizhou Province，Kaili 556000；2. Tobacco Laboratory，College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

SSR molecular marker technology as one of the most commonly used molecular markers， the marker technique result is reliable and good repeatability. In recent years， SSR marker shows a broad application prospect in tobacco genetic breeding， is a large potential for application of molecular markers. This paper introduced the principle and distribution characteristics of SSR molecular marker， and summarized the study of gene location and molecular marker-assisted selection， germplasm research， the construction of molecular genetic maps and the seed purity identification and authenticity of tobacco， and analysed the application prospect of molecular markers in tobacco genetic breeding. The main aim is to supply useful information so as to promote the development of SSR molecular marker technology research in tobacco.

tobacco；molecular marker；SSR；genetic breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.006

2014-7-30

国家烟草专卖局重点项目（110200902043）

陈杰，男，硕士研究生，研究方向：烟叶生产及科技推广应用；E-mail：hnchenjie002@126.com

王维，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：烟草栽培与生理；E-mail：wangwei@scau.edu.cn