杏鲍菇液体菌种制备条件的研究

杨丽维，王玉，陈颖，班立桐，*，刘静

（1.天津市林业果树研究所，天津300384；2.天津农学院，天津300384；3.天津鸿滨禾盛农业技术开发有限公司，天津300400）

杏鲍菇液体菌种制备条件的研究

杨丽维1，王玉2，陈颖1，班立桐2，*，刘静3

（1.天津市林业果树研究所，天津300384；2.天津农学院，天津300384；3.天津鸿滨禾盛农业技术开发有限公司，天津300400）

为了缩短杏鲍菇的制种和生产周期，提高其产量和质量，对杏鲍菇液体菌种摇瓶培养基和培养条件进行了筛选和优化研究。试验表明，适宜的培养基配方为：黄豆饼粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、0.01 g/L、蛋白胨3 g/L；适宜的培养条件是：接种量为12%、接种龄为培养4 d的菌种、装液量为100mL/250mL、摇瓶转速为150 r/min、pH为6.0。

杏鲍菇；液体菌种；制备条件

杏鲍菇又名刺芹侧耳、鲍鱼菇，是一种集食用、药用于一体的珍稀食用菌，其子实体菌肉肥厚，质地脆嫩，口感独特，营养丰富[1-2]。杏鲍菇很适合于工厂化栽培，目前生产上多数是采用固体菌种作为栽培种，这种传统的生产模式因劳动强度大、制种生产周期长、污染率高而不能满足生产的需要，不利于杏鲍菇生产的规模化和机械化[3]。由于液体菌种生产具有制种周期短，发菌速度快，菌龄一致，污染率低等优点而越来越受到人们的重视[4]。液体菌种在杏鲍菇生产上的应用，有利于杏鲍菇栽培生产的工厂化和现代化[3]。本试验对适合杏鲍菇液体菌种生长的培养基和培养条件进行了研究，旨在为杏鲍菇液体菌种的应用与推广提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

杏鲍菇，引自韩国，天津农学院生物技术教研室保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，磷酸二氢钾3，硫酸镁1.5，琼脂20，0.02，蛋白胨5，pH自然。

一级摇瓶培养基（g/L）：葡萄糖30，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，琼脂2，0.01，蛋白胨2，酵母浸出汁5，pH为5。

二级摇瓶培养基（g/L）：

A．麸皮60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，0.01，蛋白胨3。

B．玉米粉60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，0.01，蛋白胨3。

C．黄豆粉60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，0.01，蛋白胨3。

D．豆粕60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，0.01，蛋白胨3。

E．黄豆饼粉60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.50.01，蛋白胨3。

F．土豆60，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，0.01，蛋白胨3。

1.2 方法

1.2.1 菌种制备

1）斜面菌种活化：将保存的杏鲍菇菌种转接到无菌斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱中，培养10 d～12 d，得斜面母种。

2）一级摇瓶菌种制备（种子液）：按常规方法制备液体培养基后，分装于250 mL三角瓶中，装液量100mL，初始pH为5，棉塞封口，121℃高压灭菌30min，待冷却后，按无菌操作方法，每瓶接入约0.2 cm2大小的经活化的斜面菌种3块，放入25℃的恒温培养箱内静置培养2 d后，放入恒温摇床中，25℃、180 r/min振荡培养3 d。

3）二级摇瓶菌种制备（发酵液）：培养基制备方法同一级摇瓶培养基，将培养好的一级摇瓶种以10%的接种量接种于二级摇瓶中，25℃、180 r/min摇床培养4 d后取出，即可用于杏鲍菇栽培。

1.2.2 摇瓶培养基筛选

将一级摇瓶种以10%接种量分别接种于6个二级摇瓶培养基中，置于25℃、180 r/min摇床培养4 d，然后测定各配方的菌球密度、菌丝干重、菌球直径和萌发时间，每个配方重复3次。

1.2.3 最适培养条件试验

1）接种量的影响：将一级种以每瓶6%、8%、10%、12%、15%的接种量，接种于摇瓶培养基中。

2）接种菌龄的影响：分别将培养4.0、5.0、5.5、6.0、7.0 d的一级种，接种于摇瓶培养基中。

3）装液量的影响：在250mL三角瓶中分别装入50、80、100、120、150mL的培养基。

4）摇瓶转速的影响：选择摇床转速分别为100、150、180、200 r/min。

5）初始pH的影响：将培养基的初始pH分别调试为4.5、5.0、6.0、7.0、8.0，灭菌后接种培养。

以上试验均在25℃下摇床培养4 d后取出，测量菌丝干重，每个处理3次重复。

1.2.4 测量内容及方法

1）菌丝干重的测定：把培养好的液体菌种用80目的筛网进行过滤，收集菌球，用清水进行反复冲洗，而后置于恒温烘干箱中80℃烘干至恒重，用电子天平称量，重复3次，取平均值。

2）菌球密度的测定：培养结束后，取1m L发酵液摊匀于培养皿中，在暗背景下，用放大镜直观菌球数量进行计数，每瓶菌种重复记数3次，取平均值。

3）菌丝球回接平板萌发时间的测定：从培养液中取一个菌球置于PDA培养基平板中央，放置培养箱中25℃培养，每1小时观察一次，当有一组菌球萌发后，改为每0.5小时观测一次，并记录萌发时间，每组重复3次，取平均值[5]。

4）菌球直径的测定：培养结束后，随机选取15个菌球在培养皿中排成一长列，皿下衬坐标纸，测量总长度，重复3次，求平均值。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇液体菌种摇瓶培养基的筛选

表1为杏鲍菇液体菌种在不同培养基下的菌丝生长情况。

由表1可以看出。杏鲍菇液体菌种在不同培养基中均能生长，但生长情况有所差异。配方E菌丝产量高、菌丝干重最大为5.4 g/L，菌球大小均匀，密度最大，为1.04×105个/L；配方D菌丝产量低、菌丝干重最小，菌球密度小且沉淀多；配方B中的菌丝干重和密度虽然仅次于配方E，但是其菌球回接平板后的萌发时间比较长。对于杏鲍菇液体菌种来讲，菌丝干重越大，菌球密度越大，则菌种的品质越好，流动性越强，接种后越容易分散，发菌点也就越多；菌球回接平板后萌发时间越短，说明菌种的活性越强，接种后菌丝萌发和生长速度越快，越有利于生产。综合考虑，配方E液体菌种菌丝量大、密度高、回接平板萌发时间短，且菌球直径适当，确定其为适宜摇瓶培养基配方。

2.2 杏鲍菇液体菌种培养条件的优化

2.2.1 接种量

设置不同接种量水平，装液量100mL/250mL，pH5，25℃，180 r/min摇床培养4 d，测量菌丝干重。从图中可看出，随着接种量增加，菌丝干重逐渐增加，当接种量达12%时，菌丝干重最大，继续增加接种量，菌丝产量开始下降。通过试验结果分析，接种量过少，菌丝体含量少，会引起发酵前期菌体生长缓慢，延滞期延长，菌丝终产量较低；接种量过多，带入种子液中副产物过多，不利于菌丝培养，增加污染率，影响产量。因此，确定12%为适宜接种量。不同接种量对杏鲍菇菌丝生长的影响见图1。

2.2.2 接种龄

接种量12%，装液量100mL/250mL，pH 5，25℃，180 r/min培养不同天数，测量菌丝干重。图2为不同菌龄的菌丝生长情况。

可以看出，种子液培养到第4天时，杏鲍菇的菌丝体产量最高，之后随着培养天数的增加，菌丝生物量开始下降。因为接种菌龄直接影响菌丝生长活力，从而影响菌丝生长速度和生物量，而菌丝在培养后期由于营养物比例失调，代谢产物累积，菌种发生自溶，所以导致菌丝产量下降。种子液在培养到第4天时杏鲍菇菌丝体处于旺盛的指数生长期，菌丝活力强，转接后所得的菌丝干重较大。因此，确定接种最佳菌龄为4 d。

2.2.3 装液量

设置不同装液量水平，接种量12%，pH5，25℃，180 r/min摇床培养4 d，测量菌丝干重。不同装液量对杏鲍菇菌丝生长的影响见图3。

由图3可知，在250mL三角瓶中装液量为100mL时，杏鲍菇的菌丝干重最大，菌丝产量最多；装液量150mL时，菌丝产量下降明显；菌丝产量最少的是装液量为50m L。因为装液量过少，摇瓶内菌丝生长所需的营养供给量不足，同时震荡时剪切力过大易对菌丝造成较大的损伤，影响菌丝生长导致产量减少。装液量过多，液面接触的空气面积小，通气量少，单位体积溶氧量变小，菌丝缺氧而生长缓慢。综合分析，选择装液量100mL/250mL为最佳。

2.2.4 摇瓶转速

接种量12%，装液量100mL/250mL，pH 5，25℃，用不同转速摇床培养4 d，测量菌丝干重。不同摇瓶转速对杏鲍菇菌丝生长的影响见图4。

结果如图4所示，随着转速增加，菌丝生物量逐渐提高，当达到150 r/min时，菌丝产量最大，之后呈下降趋势。这是因为随着转速提高，摇瓶溶氧量不断增加，促进菌丝生长，而当转速过高时，培养基内剪切力过大，对菌丝的机械刺激加大，菌丝球形成受到了抑制。因此，确定最适摇瓶转速为150 r/min。

2.2.5 初始pH

接种量12%，装液量100mL/250mL，设置不同pH，25℃，150 r/min摇床培养4 d，测量菌丝干重。不同pH的菌丝生长情况见图5。

可以看出，杏鲍菇菌丝体在pH4.5～8.0范围内均能生长，但不同pH对菌丝生物量有较大的影响。由于培养基高温灭菌后，发酵液的pH会有所下降，菌丝体在生长过程中由于自身代谢作用会分泌一些有机酸，这些有机酸的积累会使发酵液的pH进一步降低，因此杏鲍菇菌丝体适宜在偏酸性环境中生长。本试验中，pH 6.0时，菌丝干重达到最大，故杏鲍菇液体菌种发酵最适pH为6.0。

2.3 培养基和培养条件优化后的验证实验

初始条件与优化后条件对比结果见表2。

将杏鲍菇的种子液分别置于初始条件和优化后条件下进行培养，优化后条件为：黄豆饼粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、VB10.01 g/L、蛋白胨3 g/L，调整接种量为12%、接种龄为培养4天的菌种、装液量为100m L/250m L、摇瓶转速为150 r/min、pH为6.0。观察各项指标，得出结果如下，优化后条件培养杏鲍菇液体菌种得到的各指标与初始条件相比菌丝干重提高了128.3%、菌球密度提高了107.7%、菌球直径缩短了26.1%、菌球回接平板萌发时间缩短了20.0%。

3 小结与讨论

在本试验设计条件下，采用摇瓶液体培养法，对杏鲍菇液体发酵过程中菌丝干重、密度等各项指标的变化规律进行分析，得到适宜杏鲍菇液体菌种生长的培养基配方为：黄豆饼粉60 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、0.01 g/L、蛋白胨3 g/L；最佳培养条件为：接种量12%、接种龄为培养4 d的菌种、装液量100mL/250mL、摇瓶转速150 r/min、pH为6.0。优化后条件培养杏鲍菇液体菌种与初始条件相比菌丝干重提高了128.3%、菌球密度提高了107.7%、菌球直径缩短了26.1%、菌球回接平板萌发时间缩短了20.0%。

在液体发酵过程中，杏鲍菇的菌丝形态不断发生变化，从带分枝的丝状体，直至由菌丝形成高密度的菌丝球。液体发酵要求在短时间内菌丝获得大量的营养成分，形成体积小、数量多的菌丝球，这就需要适宜的培养基和培养条件来提供菌丝生长，从而提高产量和质量。因此，确定杏鲍菇液体菌种生长的关键技术指标是非常重要的。

杏鲍菇液体菌种具有生产周期短、发菌速度快、菌龄一致、污染率低、菌种质量稳定等优势，其生产具有技术可行性和经济价值，适宜工厂化、标准化周年生产。

[1]孟丽君,王芳,张玉萍,等.杏鲍菇液体菌种的制备条件及应用研究[J].山西农业大学学报:自然科学版,2009,29(2):153-156

[2]马瑞霞,刘慧.杏鲍菇液体菌种培养基的筛选及培养条件的探讨[J].中国农学通报,2011,27(7):452-456

[3]黎勇,薛林浩,王丹,等.日引1号杏鲍菇液体制种条件研究[J].食用菌,2012(3):22-23,48

[4]刘冠卉,屠洁,张久成,等.杏鲍菇液体菌种的制备研究[J].北方园艺,2009(11):230-232

[5] 袁建平,张国凤,马立芝.杏鲍菇液体菌种培养基的筛选[J],廊坊师范学院学报,2006,22(4):82-83

[6]秦艳梅,王娟萍,冀宏,等.杏鲍菇液体菌种的生产工艺优化与应用[J].中国食用菌,2008,27(4):28-30

[7]范贵增,杨一兵,宁超美,等.液体发酵生产食用菌菌丝体条件的研究[J].食品与发酵工业,1993(1):43-50

Study on Preparation Condition of Liquid Spawn of Pleurotus eryngii

YANG Li-wei1，WANGYu2，CHENYing1，BAN Li-tong2，*，LIU Jing3
（1.Tianjin Research Institution of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Hong Bin He Sheng Agricultural Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300400，China）

The screening and optimizing of medium and culture condition in shake flask of Pleurotus eryngiiliquid spawn were studied. The purpose was to shorten the breeding and production period and to improve theyield and quality. The experiment indicated that the suitable medium formulas were soybean bread flour 60 g/L，glucose 20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，VB10.01g/L，peptone 3 g/L.The suitable culture conditions were inoculum quantity 12%，cellage 4 days，liquid quantity 100m L/250m L，rotate speed 150 r/min，pH 6.0.

pleurotus eryngii；liquid spawn；preparation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.029

2013-11-29

天津市北辰区科技发展计划项目（BCNYKJ2013-4）

杨丽维（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，主要从事农产品加工方面的研究工作。

*通信作者：班立桐（1972—），男，教授，从事食用菌产业技术教学与研究工作。