大孔树脂分离土茯苓黄酮的研究

隋欣，暴悦梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

大孔树脂分离土茯苓黄酮的研究

隋欣，暴悦梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通过测试树脂对土茯苓黄酮的吸附率、吸附速率、解吸率和产物得率及其黄酮含量，比较了5种不同类型吸附树脂对土茯苓中黄酮的吸附特性。结论5种树脂中D101树脂对土茯苓总黄酮的吸附效果最好，吸附量可达18.32mg/g，X-5次之，吸附量达18.09mg/g。动态柱吸附后，使用50%乙醇作为洗脱剂可以将被树脂吸附的黄酮全部洗下，用量为3.5倍柱体积。通过本工艺，2 kg土茯苓获得总黄酮6.27 g，得率为0.31%。经HPLC分析，总黄酮中落新妇苷含量为90.54%。

大孔树脂；黄酮；土茯苓；落新妇苷

土茯苓为百合科植物光叶菝葜的干燥根茎，具有除湿，解毒，通利关节之功效[1]。主产于广东、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等省[2]，化学成分研究表明，土茯苓中含有落新妇苷、白黎芦醇、异黄杞苷、异落新妇苷、柚皮素等多种成分[3-4]，其中二氢黄酮醇苷类（如落新妇苷）为土茯苓的有效成分[5]。近年来临床和药理试验表明，落新妇苷具有较强的抗炎、镇痛、利尿作用[6-7]。分离纯化高纯度的土茯苓黄酮对新药的开发有着重要意义。

实验以土茯苓为原料，采用大孔树脂分离纯化其所含的黄酮成分。通过分析D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5种大孔树脂的静态吸附试验，计算树脂的单位饱和吸附容量Q，以此筛选较优树脂做后续动态吸附和解吸试验，以确定此树脂分离纯化土茯苓黄酮的最佳工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 材料

土茯苓中药饮片购买于广西康美药业股份有限公司。D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5大孔吸附树脂购于郑州勤实科技有限公司。

1.2 主要试剂

乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）：以上均购于天津永大化学试剂有限公司；落新妇苷标准品：上海同田生物科技有限公司；乙腈（高效液相色谱纯）：TEDIACompany，USA。

1.3 仪器

Q-350B3型粉碎机：上海冰都电器有限公司；BSA124S型电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HF-20B型超声提取器：北京弘祥隆生物技术有限公司；754PC型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SSC300NA型三足式离心机：张家港市永泰离心机制造有限公司；RE 52-05型旋转蒸发仪、SHZ-ШD型真空泵：上海亚荣生化有限公司；TGL-16B型离心机：上海安亭科学仪器厂；Waters高效液相色谱仪：美国WATERS公司；FD-1-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验设备有限公司。

2 试验方法

2.1 土茯苓的预处理

拣选优质康美土茯苓饮片置于粉碎机中进行粉碎，过40目筛网得土茯苓粉末，装入密封袋后低温密封保存。

2.2 树脂的预处理

用无水乙醇浸泡并充分溶胀树脂一夜，用大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味，然后分别用体积分数为2%的HCl溶液、质量分数为2%的NaOH溶液浸洗树脂各一夜，再用蒸馏水洗至中性，抽滤后密封存放备用。

2.3 标品溶液的配制

将落新妇苷标准品置于干燥箱中105℃干燥至恒重，精密称取干燥后的落新妇苷标准品5 mg，置于50mL容量瓶中，以极少量的甲醇将落新妇苷溶解后，添加蒸馏水至刻度线，配成0.1mg/mL的标准品溶液，摇匀备用。

2.4 土茯苓样品高效液相色谱分析

称取土茯苓粉末0.5 g，加入甲醇25mL，室温下超声提取30min，取上层提取液用蒸馏水适当稀释，经0.45μm有机系膜过滤备用。梯度洗脱方法见表1。

2.5 土茯苓总黄酮的提取

称取干土茯苓粉末2 kg于超声提取器中，加入20 L体积分数为60%的乙醇溶液；设定好各项工作参数：超声提取总时间为45min，超声间隙为3 s，搅拌速度为800 r/min，超声温度为30℃。超声完成后取出混合液，经三足式离心机将土茯苓粉渣和提取溶剂相分离，弃去粉渣，所得提取液置于旋转蒸发仪中进行浓缩（浓缩温度为55℃），直至乙醇全部蒸出，对余下液体离心（转速为4 000 r/min），弃去沉淀，收集上清液。

2.6 大孔树脂吸附土茯苓中的黄酮

2.6.1 树脂的静态吸附和筛选

准确称取经预处理的树脂D101，NKA-9，AB-8，H103和X-5各1 g装入100mL的具塞磨口三角瓶中，加入50m L稀释后总黄酮浓度为430μg/m L的土茯苓提取液，置于20℃摇床内摇荡，每隔15分钟用移液枪吸取少量样液，样液经稀释后于291 nm下检测吸光度，以吸附时间为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制静态动力学吸附曲线。待树脂充分吸附后，测定样液吸附平衡时总黄酮的最终浓度，计算树脂的单位饱和吸附容量Q。通过比较不同树脂的饱和吸附量，筛选出较优的大孔树脂。

2.6.2 树脂的动态吸附与解吸

由树脂的静态吸附试验，对筛选出的一种理想树脂，进行动态吸附与解吸试验。把预处理好的树脂湿法装入15mm×500mm玻璃色谱柱中（柱高31 cm，柱床体积约为55mL），将稀释后的土茯苓总黄酮提取液（430μg/mL）以10mL/min速度上柱，直至吸附完全。树脂柱分别用10 0mL纯化水洗脱，可洗去水溶性杂质糖和蛋白质等，再依次用20%，50%，80%乙醇各250mL以3mL/min流速洗脱，收集洗脱液紫外检测土茯苓中的落新妇苷。分别对洗脱液进行HPLC分析。通过以上小试试验确定最佳洗脱溶剂和洗脱量。最后通过中试试验来收集土茯苓落新妇苷洗脱液。

3 结果与讨论

3.1 紫外检测波长的选择

取土茯苓提取液和落新妇苷标准品溶液，进行适当稀释后置于石英比色皿中，以各自试剂空白为参比，在波长200 nm～400 nm范围内扫描，发现落新妇苷在291 nm处有最大吸收峰，因此选择291 nm作为测定波长。图1和图2分别为样品溶液和标准品溶液紫外扫描图谱。对比图1和图2可知，土茯苓提取液和落新妇苷紫外吸收图谱基本一致，这是因为土茯苓提取液中所含成分和落新妇苷均为黄酮类化合物，具有明显的紫外吸收光谱特征，它们在291 nm下具有最大吸收波长，浓度与吸光强度变化遵循朗伯比尔定律，土茯苓中总黄酮浓度以落新妇苷浓度计量。

3.2 标准曲线的绘制

精密量取落新妇苷标品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0、2.4mL分别置于刻度为10mL的试管中，依次加蒸馏水至10mL，摇匀，以蒸馏水做空白。在291 nm处测量以上各溶液的吸光度，以落新妇苷的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图3，得标准曲线的方程为Y=41.179X＋0.028 3，R2=0.999 7，浓度在0mg/mL～0.024mg/mL之间呈良好的线性关系（见图3）。

3.3 树脂的静态吸附结果

3.3.1 树脂的静态吸附动力学曲线

在20℃摇床中，考察了D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5种树脂对土茯苓总黄酮吸附率和吸附时间的关系，绘出了静态吸附动力学曲线，其结果如图4所示。

由图4可知，D101对土茯苓总黄酮的吸附速度最快，X-5与D101吸附速率相当；D101、NKA-9、AB–8和X-5在2.5 h内基本达到平衡，而H103在4 h内还未达到平衡。

3.3.2 树脂的筛选

在相同的条件下，吸附树脂的种类不同，吸附能力也有所不同。不同种类树脂吸附能力的差异是由于树脂表面积的大小及其极性存在差异。按公式（1）计算树脂的单位饱和吸附容量Q（见表3）。

式中：Q为吸附率，（mg/g）；C0为初始浓度，（mg/mL）；Cr为剩余浓度，（mg/m L）；V为溶液体积，m L；W为树脂质量，g。

试验表明，大孔树脂D101对总黄酮的吸附容量最大，为每克干树脂18.32mg/g，选择D101大孔树脂做后续实验。大孔树脂D101是非极性树脂，其孔表疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适于极性溶剂中吸附非极性物质。

3.4 树脂的动态吸附及解吸结果

根据树脂静态吸附试验，我们选取D101做后续试验，对D101树脂动态吸附落新妇苷和解吸进行研究。结果表明当用20%的乙醇洗脱树脂柱时，其他黄酮成分及部分落新妇苷能被洗脱下来；当用50%的乙醇洗脱树脂柱时，大量落新妇苷被洗脱下来；当用80%的乙醇洗脱时，液相图中未见落新妇苷出峰，说明树脂柱中的黄酮已被完全洗脱。

通过以上试验，确定土茯苓黄酮的纯化步骤为：先用2倍柱体积纯净水洗去水溶性杂质糖和蛋白质等，再用50%乙醇洗脱树脂柱上的总黄酮。图5为50%乙醇洗脱曲线。

由图5可知，在乙醇用量为柱体积的0.5倍～1.2倍时，随着乙醇用量的加大，流出液中黄酮的含量逐渐增加；当乙醇用量继续加大时，流出液中黄酮的浓度又逐渐的降低；当乙醇用量为柱体积的3.5倍左右时，已基本将黄酮洗净。因此最终确定，50%乙醇用量为3.5倍柱体积。

3.5 纯化产物的HPLC分析

对步骤2.6收集到的土茯苓黄酮粗品进行HPLC（见图6）分析可知，黄酮中主要成分落新妇苷的纯度可达90.54%。2 kg土茯苓经D101大孔树脂分离纯化后可得6.27 g土茯苓黄酮，得率为0.31%。

4 结论

本试验对土茯苓中黄酮成分的分离纯化进行了研究，发现D101、NKA-9、AB-8、H103、和X-5这5种树脂，D101对土茯苓总黄酮的吸附效果最好，吸附量可达18.32mg/g，而X-5其次，为18.09mg/g。树脂柱洗脱时，先用2倍柱体积纯净水洗去水溶性杂质糖和蛋白质等，再用50%乙醇洗脱树脂柱上的黄酮成分，洗脱用量确定为柱体积的3.5倍即可。洗脱液经浓缩、冷冻干燥后得到土茯苓黄酮中落新妇苷的含量为90.54%。经上述工艺步骤，2 kg土茯苓共得6.27 g土茯苓黄酮，得率为0.31%。该工艺步骤简单，得率较高，是一种值得推广的土茯苓黄酮提取工艺。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:14-15

[2] 李玉莲,李玉琪,曾平,等.土茯苓植物资源调查[J].中草药,2002,33 (9):850-852

[3]陈广耀,沈连生,江佩芬.土茯苓中二氢黄酮醇甙的研究[J].中国中药,1996,21(6):355

[4]陈广耀,沈连生,江佩芬.土茯苓化学成分的研究[J].北京中医药大学学报,1996,19(1):44

[5]陈红梅,秀兰,吴占全.土茯苓的化学与药理研究进展[J].中国民族医药,2008(11):71-73

[6] 张白嘉,刘亚欧,刘榴,等.土茯苓及落新妇苷抗炎、镇痛、利尿作用研究[J].中药药理与临床,2004,20(1):11-12

[7] 吴丽明,张敏.土茯苓中落新妇苷的利尿和镇痛作用[J].中药材, 1995,18(12):627-630

Study on the Separation of Glabrous Greenbrier Rhizome Flavonoids by Macroporous Resin

SUIXin，BAOYue-mei
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Through the test of resin adsorption on Glabrous Greenbrier Rhizome flavonoids， adsorption rate，ratio of desorption， the yield rate and the content of flavonoid， Compared the adsorption characteristic of 5different kinds of adsorption resins for flavonoids from Glabrous Greenbrier Rhizome. The best adsorption effectof five kinds of resin and D101 resin for total flavonoids in Glabrous Greenbrier Rhizome， adsorption capacitywas 18.32 mg/g， and the X-5 followed， 18.09 mg/g. After the dynamic column adsorption， flavonoids using50 % ethanol as eluant can be adsorbed by the resin eluted all yieid， the amount of 3.5 times the columnvolume. Through this process， 2 kg Glabzons Greenbiere Rhizowe 6.27 g flavonoids， yield 0.31 %. By theanalysis of HPLC， total flavonoids astilbin content was 90.54 %.

macro-reticular resin；flavonoid；Glabrous Greenbrier Rhizome；Astilbin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.012

2015-01-08

隋欣（1982—），男（汉），工程师，本科，研究方向：食品微生物检测。