响应面法优化紫薯花青素的超声波提取工艺

肖海峻，孟利前，施鹏飞

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442）

响应面法优化紫薯花青素的超声波提取工艺

肖海峻，孟利前，施鹏飞

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442）

超声波技术是用于天然产物有效成分提取的一种非常有效的方法。本试验中以紫甘薯为研究对象，利用该技术对影响花青素提取的影响因素提取剂比例、提取温度、提取时间和料液比进行单因素试验，在此基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，以吸光度为响应值，研究上述几个因素对花青素的影响并对提取工艺进行优化，确定最佳工艺参数是：提取温度49℃，提取时间15min，料液比1∶41（g/mL），在此条件下紫甘薯花色苷吸光度达到1.45。

响应面分析法（RSM）；紫甘薯；花青素；超声波提取技术

植物色素在植物中分布广泛，种类繁多，花青素是一类花色素糖苷类化合物的水溶性色素，在自然状态下，与植物体内的各种单糖结合形成糖苷，又称花色苷（Anthocyanins）[1]，花青素在酸性条件下呈红色或紫色，热、光、氧稳定性较好，其颜色的深浅与花青素的含量呈正相关。具有优越的着色性能，已作为食品添加剂应用于配料酒、饮料、冰激凌、果酱、糕点等产品[2-3]。此外，花青素还具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、消炎、抗癌以及预防心血管系统疾病等多种生理功效[4-7]，被广泛应用在药品、食品、化妆品等方面。

花青素提取过程中常用到的提取剂主要有甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，但这些提取剂的残留会对花青素的应用造成负面影响，为解决上述问题，有学者采用酸化乙醇替代有机溶剂提取紫薯花青素[8-9]。本试验是在前人研究的基础上，以乙醇盐酸为提取剂，利用超声波提取技术对紫甘薯花色苷提取工艺进行优化，旨在探索紫甘薯花色苷提取的最佳工艺参数，为花青素的大规模生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

紫罗兰，由大兴区庞各庄镇甘薯基地提供。

1.2 所用仪器型号及生产商

FW80高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GL-88B旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-300型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Eppendorf离心机5804R：北京博仪恒业科技发展有限公司；SHB-Ⅲ真空循环水势多用泵：郑州长城科工贸有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯粉的制备

将紫色甘薯洗净、切成3 mm薄片，然后在烘箱45℃条件下烘干至恒重，粉碎后过60目筛，避光保存备用。

1.3.2 方法

精确称取紫薯粉1.0 g，加入适量的提取剂（由95%乙醇和0.1%HCl按比例混合而成），按设定的提取温度、提取时间及料液比在超声波下提取，样品在离心机中以3 500 r/min离心5min，得到澄清的花青素上清液，将上清液取出并定容到100mL，放入紫外分光光度计中在波长为520 nm下测其吸光度，记录结果，每组试验3次重复取平均值[10-12]。

1.4 设计

1.4.1 单因素试验

1.4.1.1 最佳提取剂比例的筛选

将95%乙醇和0.1%HCl分别按比例为50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、30∶70和25∶75的比例配制，然后按料液比为1∶10加入提取剂进行超声波辅助萃取，超声浸提的温度为40℃，超声波震荡时间为15min，然后离心5min，将上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波长下测定其吸光度。

1.4.1.2 最佳提取温度的筛选

超声波浸提温度分别设置为30、40、50、60、70℃，按照料液比为1∶10加入提取剂（95%乙醇和0.1% HCl的比例为40∶60）进行超声辅助萃取，超声波震荡时间为15min，然后离心5min，将上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波长下测定其吸光度。

1.4.1.3 最佳提取时间的筛选

超声波震荡时间分别设置为5、10、15、20、25、30 min，按照料液比为1∶10加入提取剂（95%乙醇和0.1%HCl的比例为40∶60）进行超声辅助萃取，超声波浸提温度为40℃，然后离心5min，将上清液吸出并定容至100mL，在520 nm波长下测定其吸光度。

1.4.1.4 最佳料液比的筛选

料液比分别设置为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，加入提取剂（95%乙醇和0.1%HCl的比例为40∶60）进行超声辅助萃取，超声波浸提温度为40℃，超声波浸提时间为15min，然后离心5min，将上清液吸出并定容至100mL，在520nm波长下测定其吸光度。

1.4.2 响应面法优化超声波提取工艺

在单因素实验基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析方法，将自变量的实验水平分别以-1、0、1进行编码（因素水平设计见表1），以吸光度为响应值进行分析，共设计17个实验点，其中12个为析因点，5个零点实验用以估计实验误差[13]。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验实验结果及分析

2.1.1 提取剂比例对吸光度的影响

从图1可以看出，在其他条件不变的情况下，提取剂（95%乙醇∶0.1%HCl）按照不同的体积比例配制时，对吸光度的影响比较大。随酸的含量增加时，吸光度的值也增加，当95%乙醇和0.1%HCl比例达到35∶65时，吸光度的值达到最大，表明此时花青素的含量达到最高，提取效果最好。超过该值时，当酸的含量再继续增加时，吸光度的值反而减小了，表明花青素的提取率下降了。出现这种现象的原因可能与花青素结构有关，花青素结构中含有酚羟基，有酸性，此外其结构中的吡喃杂环上的氧原子为四价，使其具有碱性，其两性特征使花青素的色调以及稳定性受pH变化的影响较大。提取剂的pH过高或者过低都会直接影响到色素的提取效果和色素的色调。

2.1.2 提取温度对吸光度的影响

当提取剂比（95%乙醇∶0.1%HCl）为40∶60，料液比为1∶10，超声波震荡时间为15min时观察不同浸提温度对吸光度的影响。

由图2可以看出，在30℃到50℃范围内，随着温度的升高，吸光值呈增加趋势，表明提取液花色苷含量呈增加趋势，当提取温度达到50℃时花色苷含量最高，表明此时花青素含量达到最大；50℃之后，花色苷含量随温度的升高而降低，这可能是由于过高的温度会对花青素具有破坏作用从而降低其含量。

2.1.3 提取时间对吸光度的影响

当提取剂比（95%乙醇∶0.1%HCl）为40∶60，料液比为1∶10，超声波清洗器的温度为40℃时观察不同浸提时间对吸光度的影响。

由图3可知，吸光度随着时间的延长呈现先增加后减小的趋势，在提取时间为15min时达到最大值，出现这种现象的主要原因是：由于开始时花青素随时间的延长而不断被溶解出，在不太长的时间内即可提取得较为完全；色素在加温溶液中稳定性可能随时间延长而发生变化，因此当提取时间继续延长，花青素因氧化分解反而致使含量降低。

2.1.4 料液比对吸光度的影响

当提取剂比（95%乙醇∶0.1%HCl）为40∶60，超声波清洗器的温度为40℃，超声波震荡时间为15min时观察不同料液比对吸光度的影响。

由图4可知，吸光度随提料液比的增加而增加，在料液比为1∶40时达到高峰，之后随料液比的增加有增大的趋势，但趋于平缓。这可能是随着提取剂加入量的增加，色素逐渐溶解到溶液中，当提取剂达到一定量时，色素溶解趋于饱和，即料液比在1∶40时花青素含量趋于饱和，达到比较稳定的状态。

2.2 响应面法优化提取紫薯花青素的实验结果与分析

应用响应面法，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，综合单因素试验，实验设计及结果如表2。

利用Design-Expert.V8.0.6.1软件，通过对表2中吸光度试验数据进行多元回归拟合和回归模型方差分析（表3），获得紫甘薯花青素吸光度对编码自变量提取温度（A）、提取时间（B）和料液比（C）的二次多项回归方程：

吸光度=1.44623-0.032 55A＋0.021 89B＋0.029 91C＋0.041 69AB-0.059 66AC-0.007 78BC＋0.002 69BC-0.174 21A2-0.115 52B2-0.095 36C2

在试验范围内，对于超声波提取对紫薯花青素吸光度的影响，一次项的偏回归方程系数的绝对值A> C>B，说明提取温度对紫甘薯花青素吸光度影响最大，其次是料液比，影响最小是提取时间。

从表3可以看出，本试验所选用的二次多项模型极显著性（PModel＜0.000 1），失拟项不显著（P= 0.463 4＞0.05），回归模型的相关系数R2为0.993 56，说明该模型能够解释99.356%的响应值变化，模型拟合程度较好，对实践具有指导意义，可以用此模型对紫甘薯花青素的吸光度进行分析和预测。

为了观察某个因素及其交互作用同时对吸光度的影响，将其他因素条件保持不变，获得每个因素及其交互作用对吸光度影响的一组动态等高线图及其响应曲面图（图5～图7），从而确定因素的最佳水平范围。

从提取温度和提取时间对吸光度的等高线和响应曲面（图5）可以看出，当料液比达到最佳值时，随着提取温度的增加，吸光度先增大后减小；随着提取时间的延长，吸光度先增大后减小。由图5可以确定最佳水平范围即提取温度为48℃～50℃，提取时间为14min～16min。

从提取温度和料液比对吸光度的等高线和响应曲面（图6）可以看出，当提取时间达到最佳值时，随着提取温度的增加，吸光度先增大后减小；随着料液比的增加，吸光度先增大后减小。由图6可以确定最佳水平范围即提取温度为49℃～51℃，料液比为1∶38 g/m L～1∶42 g/m L。

从提取时间和料液比对吸光度的等高线和响应曲面（图7）可以看出，当提取温度达到最佳值时，随着提取时间的延长，吸光度先增大后减小；随着料液比的增加，比吸光度先增大后减小。由图7可以确定最佳水平范围即提取时间为14min～16min，料液比为1∶39 g/mL～1∶41 g/mL。

等高线的形状反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反；同时响应面图三维图的形状也反映出交互效应的强弱，陡为两因素交互作用显著，而不陡则与之相反；由图5至图7可知，提取温度和料液比交互作用及其显著，提取温度和时间交互作用显著，但提取时间和料液比交互作用不显著。

2.3 最优提取工艺参数优化结果

通过Design-Expert软件进行分析，得到回归方程的最大值点为提取温度49.41℃，提取时间15.34min，料液比1∶40.96，预期的吸光度为1.451 74。考虑到实际操作中遇到问题，将提取工艺条件修正为：提取温度49℃，提取时间15min，料液比1∶41 g/mL，按此工艺参数做3次平行实验，吸光度为1.445 73，与理论预测值1.451 74相比，相对误差为0.601%，证明了方程的可靠性与响应面分析法的有效性。

3 结论

利用响应面法建立了超声波提取紫薯花青素的数学模型，以吸光度为响应值，各因素影响的主次顺序为：浸提温度>料液比>提取时间。通过提取工艺响应面研究，确定了超声波提取紫薯花青素的最佳工艺参数为：提取温度49℃，提取时间15min，料液比1∶41 g/mL，在此条件下紫甘薯花色苷吸光度达到1.45。综上所述，利用响应曲面法对紫甘薯花色苷的提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，可以减少工艺操作的盲目性，为进一步的试验研究奠定一定基础。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction for Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Method

XIAO Hai-jun，MENG Li-qian，SHI Peng-fei
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing102442，China）

Ultrasound technology is a very useful way which is used to extract active ingredients from natural product.In this experiment，some factors affecting the ratio of extraction of proanthocyanidins such as extraction solvent ratio，extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquid are studied respectively by ultrasound technology based on purple sweet potatos.The preparation process of anthocyanins from purple sweet potato was optimized according to Box-Behnken central composition design principle on foundation of single factor experiment，the method of response surface methodology（RSM）with 3 factors and 3 levels combined with Design-Expert data analysis software was adopted with the extraction yield of anthocyanins from purple sweet potato as the absorbance.The effect of several factors above on the efficiency of extraction of anthocy anins from purple sweet potato were studied in this paper.According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows：extraction temperature 49℃，extraction time 15min，ratio of material to liquid 1∶41（g/mL）.Under these conditions，the absorbance of anthocyanins from purple sweet potato reached 1.45.

response surface methodology （RSM）；purple sweet potato；anthocyanins；ultrasonic-assisted extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.009

2013-12-18

北京农业职业学院博士基金项目—紫甘薯花青素提取工艺研究

肖海峻（1966—），女（汉），教授，博士，研究方向：植物种质资源的开发与利用。