冬虫夏草联合脂肪源性干细胞移植对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用*

成远强，赵 龙，闫园园，苏国栋，王 莹

(1.牡丹江医学院影像学院，黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

·实验研究·

冬虫夏草联合脂肪源性干细胞移植对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用*

成远强1，赵 龙1，闫园园1，苏国栋1，王 莹2

(1.牡丹江医学院影像学院，黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

目的：探讨冬虫夏草促进脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)对大鼠缺血/再灌注损伤神经保护作用。方法：线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，将动物随机分为：模型对照组、冬虫夏草组、ADSC移植组、冬虫夏草+ADSC组。术后7d行神经功能缺陷评分(NSS)、悬垂实验及被动活动实验，采用实时荧光定量PCR分别检测梗死区炎症介质Iba-1、IL-1Β和TNF-α mRNA的表达水平。结果：冬虫夏草+ADSC组NSS评分显著低于单独治疗组和模型对照组，而悬垂实验及被动活动评分则显著增高 (P<0.05)。与模型对照组和单独治疗组对比，冬虫夏草+ADSC组梗死区Iba-1、IL-1Β和TNF-α mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。结论：冬虫夏草联合ADSC移植对大鼠脑缺血神经保护作用优于单独治疗组，其机制可能与冬虫夏草和ADSC能够协同发挥抗炎症作用有关。

冬虫夏草/药效学；脂肪源性干细胞；缺血再灌注损伤；运动功能；动物模型，大鼠

脑缺血疾病是世界范围内人类第三大致死的主要原因，比心血管疾病更容易留下严重后遗症，需要长期的康复和护理。近年来细胞治疗作为脑缺血疾病新的治疗方法得到人们的重视[1]。笔者前期研究[2-3]已证实，脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)可抑制梗死灶炎症趋化因子，促进脑缺血损伤功能恢复，但效果并不显著。有研究[4]证实，联合治疗可能累加或协同单独治疗的作用和临床效果。冬虫夏草作为我国传统中药，具有补虚损、益精气等功效，能够进行免疫调节[5]。本研究首次通过冬虫夏草联合ADSC移植治疗大鼠脑缺血模型，观察梗死区炎症递质Iba-1、IL-1 β和TNF-α表达，探讨冬虫夏草与干细胞联合对脑缺血损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量260～300 g，购自中国医科大学实验动物中心，中心许可证号号: SYXK(辽)20080013。

1.2 药品与试剂

冬虫夏草精粉，安徽农业大学虫生真菌研究所提供,批号 031224。PKH-26 体外荧光标记试剂盒，美国Sigma公司产品，批号MINI26；荧光定量PCR试剂盒，日本Takara公司产品，批号CK901H；引物设计，大连宝生物工程有限公司；胎牛血清，美国Hyclon公司产品，批号0407。

1.3 ADSC培养及PKH26 体外荧光标记

脂肪组织由中国医科大学盛京医院整形外科提供，来自于30～45岁要求去除腹部多余脂肪的健康成人(均知情同意)。参照前期的方法[2]进行分离培养ADSC，换液传代，取第4～5代的ADSC制成单细胞悬液。

1.4 动物分组与模型的建立

大鼠按体质量进行随机区组法分为模型对照组、冬虫夏草组、ADSC组、冬虫夏草+ADSC组4组，每组10只。线栓改良法[6]制备大鼠大脑中动脉缺血模型。模型对照组：单纯造模，不予任何干预。冬虫夏草组和冬虫夏草+ADSC组于建模成功后每天注射冬虫夏草(100 g冬虫夏草精粉加400 mL蒸馏水溶解过滤灭菌，0.5 mL/d,7 d)。ADSC组和冬虫夏草+ADSC组于建模成功2 d后经尾静脉注射ADSC悬液(500 μL ，4×104个/μL)[3]，其余两组注射等体积的PBS。

1.5 检测指标

1.5.1 神经功能评估

缺血后7 d，采用神经功能损害评分表(NSS)，从运动、感觉、反射、平衡4方面进行神经功能损害评估。

1.5.2 被动活动实验

缺血后7 d，将大鼠放在被动活动仪上(转速设定每分钟15圈)，记录3 min每只小鼠的停留时间[6]。

1.5.3 悬垂实验

缺血后7 d，轻执大鼠尾部，将其放在金属横杆上，小心让小鼠两前肢接触横杆，然后松开尾巴，按5级评分标准[6]进行评分，记录停留横杆时间。

1.5.4 梗死区组织Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相对表达

按荧光定量PCR试剂盒说明书取各组大鼠梗死区组织进行RNA提取、PCR反转录、检测及荧光定量分析。各引物的序列为: Iba-1，上游5′-TTCCTTCTCTATTACCCCTG-3′，下游5′- GGTGTTCCTTTTCTTCTCTTGC-3′，扩增长度为163bp。 IL-1 β，上游5′-GAAGTCAAGACCAAAGTGG -3′，下游5′-GACTCAACCTTCCTCTCCA-3′，扩增长度为202bp。TNF-α，上游5′-3′CAGGGCAATGATCCCAAAGTA-3′，下游5′-GCAGTCAGATCATCTTCTCGA-3′。β-actin，上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′，下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′，常规利用 2- △△ CT 方法进行分析。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 ADSC的培养

接种1d后细胞贴壁，呈成纤维细胞样外观。2 d 后细胞伸展呈长梭形，7 d后细胞可形成较密集的细胞群落。

2.2 各组NSS评分、被动活动实验及悬垂实验结果对比

缺血后7 d，与模型对照组对比，冬虫夏草组、ADSC组和冬虫夏草+ADSC组NSS评分降低，悬垂实验及被动活动实验评分增高，差别有统计学意义(P<0.05)，其中冬虫夏草+ADSC组作用显著优于冬虫夏草组和ADSC组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组NSS评分、被动活动实验及悬垂实验结果对比

表1 各组NSS评分、被动活动实验及悬垂实验结果对比

组 别动物数NSS评分/分被动活动实验/s悬垂实验/s模型对照组1014．26±1．3842．35±13．893．52±0．65冬虫夏草组109．35±1．24∗75．69±14．30∗7．85±1．91∗ADSC组108．91±1．11∗69．22±12．25∗9．47±1．66∗冬虫夏草+ADSC组106．32±0．61∗#△125．22±19．6∗#△12．46±1．73∗#△

注：与模型对照组对比，*P<0.05；与冬虫夏草组对比，#P<0.05；与ADSC组对比，△P<0.05。

2.3 各组梗死区组织Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相对表达对比

与模型对照组对比，各治疗组梗死区Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相对表达均降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与冬虫夏草组和ADSC组对比，冬虫夏草+ADSC组梗死区Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相对表达降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组梗死区组织Iba-1、IL-1β和TNF-α mRNA相对表达对比

组 别动物数 Iba⁃1 IL⁃1β TNF⁃αmRNA模型对照组100．47±0．80．073±0．0170．0096±0．0016冬虫夏草组100．25±0．04∗0．052±0．010∗0．0063±0．0015∗ADSC组100．29±0．06∗0．046±0．008∗0．0071±0．0009∗冬虫夏草+ADSC组100．16±0．03∗#△0．035±0．007∗#△0．0046±0．0011∗#△

注：与模型对照组对比，*P<0.05；与冬虫夏草组对比，#P<0.05；与ADSC组对比，△P<0.05。

3 讨 论

目前干细胞移植已成为脑缺血疾病新的治疗方向。各种来源的干细胞治疗脑缺血损伤已经进入了临床前评估阶段，其中ADSC可较容易地从患者体内获得，避免了伦理道德问题，并具有创伤小、无移植免疫排斥反应、易传代等优势，已被广泛运用于神经再生领域[7]。Jafarzadeh[8]证实，在脑损伤后24～72 h内自体静脉注射ADSC对于缺血性疾病是一种安全和可行的治疗方法, 并有助于改善功能恢复。

大脑中动脉闭塞后发生缺血/再灌注损伤炎症反应[1]，如小神经胶质细胞活化、中性粒细胞浸润以及IL-1β、Iba-1和TNF-α等促炎症细胞因子产生，对损伤灶发生和发展发挥着重要作用。有研究证实：在炎症基因敲除小鼠或药物抑制这些炎症介质后，可降低脑缺血后细胞死亡和组织损伤程度[6]。以前的研究[6]显示：干细胞有抗炎症和免疫特性。笔者前期研究[3]也发现：ADSC移植能够显著抑制脑梗死灶PARP、NF-κ、CXCL1、CXCL2等炎症介质，但其单独治疗的效果并不显著，而采用干细胞联合其他药物的方式进行治疗，在降低梗塞面积大小、促进神经功能恢复以及延迟治疗时间窗等方面都有更为积极的作用。

冬虫夏草(又名中华虫草)是一种富含虫草酸、多糖、氨基酸、多种微量元素的名贵中药。《药性考》[9]认为其能够秘精益气，专补命门。现代医学也证实冬虫夏草具有调控机体免疫反应、抗炎、改善心血管疾病等广泛的药理学作用[5]。先前的研究[5]发现：在大鼠局灶脑缺血模型中，冬虫夏草通过对氧化应激和炎症的抑制能够减少脑梗死面积和神经功能损伤。本研究结果示冬虫夏草治疗后，梗死区炎症介质IL-1β、Iba-1和TNF-α显著降低，再次证实冬虫夏草可能通过抑制炎症因子表达促进脑缺血损伤功能恢复。另外，ADSC结合冬虫夏草会显著降低IL-1β、Iba-1和TNF-α在梗塞灶的表达；且联合组NSS评分显著低于单独治疗组和模型对照组，而悬垂实验及被动活动实验结果则显著增高。此证实：联合治疗不仅有利于神经功能再生，而且能够对缺血再灌注损伤造成的部分肌力丧失及共济运动失调有保护作用[6]。笔者推测联合治疗的神经保护机制可能有以下两个方面：一是ADSC可以降低脑缺血后在缺血边界区的炎症反应；二是冬虫夏草可能通过抗炎、调节免疫反应为移植的ADSC和局部细胞的修复创造一个稳定的微环境。

综上所述，本研究首次探讨联合应用ADSC和冬虫夏草治疗大鼠脑缺血损伤，证实了联合治疗可抑制梗死区炎症介质IL-1β、Iba-1和TNF-α表达，促进脑缺血神经功能恢复。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0059-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.29

王莹，硕士生导师，副教授，博士，yingwang770224@163.com

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201310229003)；牡丹江医学院大学生科研立项学术研究项目(201302)

2014-11-12；

2014-12-18