人参牡丹胶囊的提取工艺研究*

2015-04-05李向阳周志敏张留记

中医研究 2015年3期

关键词：牡丹皮芍药皂苷

李向阳，周志敏，张留记

(1.河南省食品药品检验所，河南郑州 450003； 2.河南中医学院，河南郑州 450046；3.河南省中医药研究院，河南郑州 450004)

·药学研究·

人参牡丹胶囊的提取工艺研究*

李向阳1，周志敏2，张留记3

(1.河南省食品药品检验所，河南郑州 450003； 2.河南中医学院，河南郑州 450046；3.河南省中医药研究院，河南郑州 450004)

目的:优选人参牡丹胶囊提取工艺的最佳条件。方法:采用正交试验法L9(34),对影响人参牡丹胶囊提取工艺的主要因素进行了研究。结果：优选出人参牡丹胶囊的最佳提取工艺为水煎提取最佳工艺为8倍量水，煎煮3次，每次2 h。结论:该提取工艺合理可行。

人参牡丹胶囊；人参；牡丹皮；提取工艺;正交试验；人参皂苷；芍药苷

人参牡丹胶囊是按中医益气活血理论配伍而成的创新药物，处方由人参和牡丹皮组成，具有益气通络、活血化瘀的功效，可用于气虚血瘀型中风病的治疗。据报道，人参中主要含有多种皂苷、挥发油、多糖、有机酸、蛋白质、甾醇及其苷、多肽、黄酮等成分[1]，其中人参总皂苷是人参的主要有效成分。目前已从人参中分离提取出了人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rg3等40多种皂苷单体[2]，人参总皂苷及人参皂苷Rb1、Rb3和Rg1等单体具有保护脑缺血和免疫调节作用[3-5]。牡丹皮中主要含有芍药苷、牡丹皮原苷等多种单萜及苷类成分、挥发性成分及甾醇生物碱等[6]。牡丹皮中的苷类成分具有镇痛、抗炎、免疫调节、抗血栓等多种药理活性[7]，其中芍药苷可改善局灶性脑缺血模型大鼠的神经行为学、脑组织含水量、组织病理学改变和血脑屏障通透性，显著增加大脑局部血流量，抗神经元凋亡[8-9]。考虑到人参和牡丹皮主要成分多为水溶性成分，拟采取水煎煮的提取方法。本研究采用正交实验对工艺参数进行了优化和筛选，确定了最佳工艺参数。

1 药品、试剂与仪器

人参和牡丹皮饮片，均购自张仲景大药房。芍药苷对照品(批号110736-201035)、人参皂苷Rd对照品(批号111818-201001)、人参皂苷Rg1对照品(批号0703-200016)、人参皂苷Re对照品(批号110754-200320)、人参皂苷Rb1对照品(批号110704-200318)，均为含量测定用对照品，由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈为色谱纯，德国Merck.公司产品；水为自制重蒸水；其余试剂均为分析纯。美国Waters高效液相色谱仪(2695溶剂管理系统，2996二极管阵列检测器，Waters柱温箱，Empower II色谱工作站软件)，美国Waters公司产品；ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)日本岛津公司产品；LIBROR L-160DTP型万分之一分析天平，日本岛津公司产品；METTLER AE240型十万分之一分析天平，产地瑞士。

2 方法与结果

2.1 正交试验因素水平的确定

拟对煎煮时间、煎煮次数、加水量等主要影响因素进行考察，选用L9(34)正交实验表进行设计，每个因素选取3个水平，设定的因素水平表见表1。

表1 煎煮试验的因素水平表

2.2 实验设计和方法

2.2.1 正交实验设计

按处方比例，平行称取9份人参和牡丹皮药材，按表3正交试验表的试验条件分别进行煎煮，煎液浓缩，定容至100 mL量瓶中，制成1～9号样品液。煎煮试验的正交实验安排和实验方法见表3。

2.2.2 人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的含量测定

色谱条件与系统适应性试验： SHIMADZU ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱(0—35 min，19%A；35—45 min，19%A→29%A；45—55 min，29%A；55—85 min，29%A→40%A；85—95 min，40%A→70%A；95—100 min，70%A)，流速1.0 mL/min；检测波长203 nm；柱温35 ℃。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应不少于3 000。

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg12.58 mg，人参皂苷Re 1.97 mg，人参皂苷Rb12.67 mg，人参皂苷Rd 3.57 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密吸取1～9号样品溶液各10 mL，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，用20 mL氨试液洗涤，弃去氨水层，分取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，作为1～9号供试品溶液。

标准曲线的绘制：分别精密吸取上述混合对照品溶液2，10，15，20，30 μL，注入液相色谱仪，测定。以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，回归方程线性范围及相关系数(r)见表2。

表2 回归方程、线性关系及相关系数

测定法：分别精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，1～9号正交试验供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定供试品色谱中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的含量，计算出1～9号样品液中人参皂苷的总量，见下表3。对人参总皂苷的统计结果进行方差分析，结果见表4。有关人参皂苷测定对照品和供试品的HPLC色谱图见图1。

A对照品；B供试品图1 正交试验人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd测定HPLC色谱图

2.2.3 芍药苷的含量测定

色谱条件与系统适应性试验： SHIMADZU ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm),流动相为0.5 mL/L磷酸水溶液—甲醇(76∶24)，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温35 ℃，理论塔板数按芍药苷峰计算应不少于2 000。

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷1.42 mg，至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每毫升含0.056 8 mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密吸取1～9号样品的上清液各5mL，置三角瓶中，缓缓滴加无水乙醇15 mL，振摇，静置约2年 h，滤过，取续滤液作为1～9号供试品溶液。

标准曲线的绘制：分别精密吸取上述对照品溶液5，10，15，20，25 μL，注入液相色谱仪，测定。以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，回归方程线性范围及相关系数(r)见表2。

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液10 μL，1～9号正交试验供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定供试品色谱中芍药苷的含量，计算出1～9号样品液中芍药苷的总量，见下表3。对统计结果进行方差分析，结果见表4。有关芍药苷测定对照品和供试品的HPLC色谱图分别见图2。

A对照品；B供试品图2 正交试验芍药苷测定HPLC色谱图

表3 正交试验设计和结果

表4 正交试验的方差分析结果

注：F0.10(2，2)=9.00，F0.05(2，2)=19.00。

由表4可以看出，因素A即提取次数对人参总皂苷和芍药苷的提取量有极显著影响，而因素B、C对人参皂苷影响较为显著，对芍药苷影响较小，不呈显著性。由表3的直观分析结果可知，人参皂苷的最佳提取次数为3次，芍药苷为2次，但提取2次与3次芍药苷提取结果接近；因素B和C的人参皂苷最佳水平分别为2 h和10倍量。因此，确定的最佳的提取工艺条件为A3B3C3，即人参牡丹胶囊水煎煮的最佳工艺参数为人参和牡丹皮加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

3 讨论

根据人参牡丹胶囊中药材的主要有效成分水溶性较好的特点，选用加水煎煮的方式进行提取。在实验中，分别以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和芍药苷为测定指标，多指标考察,综合分析，优选出了人参牡丹胶囊的最佳煎煮提取工艺条件。

在人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和芍药苷的测定中，采用与《中国药典》2010版一部药材项下含量测定方法一致的HPLC法。在测定人参皂苷时，本文所选流动相可使Rb1和Rd的出峰时间提前，减少了分析时间，提高了工作效率;在待测成分出峰结束后，提高流动相中乙腈的比例，去除样品杂质对后续测定的干扰，可有效保护色谱柱。

[1]郭秀丽，张淑莲.人参化学成分和药理研究进展[J].中医临床研究,2012,4(14):26-28.

[2]窦德强,薪玲,陈英杰,等.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望[J].沈阳医科大学学报，1999，16(2):151-156.

[3]石楸鸣.人参皂苷的药理作用研究进展[J].中国药房，2010,21(31)：2967-2968.

[4]曹丽，顾学文，张天一，等.人参皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响及作用机制初步探讨[J].中国免疫学杂志，2011,27(5)：423.

[5]樊兴娟，柯开富，姜正林，等.人参皂苷单体对大鼠局灶性脑缺血再灌注的神经保护研究[J].中华医学杂志，2006,86(29)：2071-2074.

[6]王祝举，唐力英，赫炎.牡丹皮的化学成分和药理作用[J].国外医药：植物药分册，2006,21(4)：155-159.

[7]王艳华,吴德玲,刘劲松,等.牡丹皮中丹皮总苷的提取工艺研究[J].安徽中医学院学报,2012,31(2):69-71.

[8]王君萍，韦颖梅，郭梅，等.芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡相关基因的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008,6(3):310-312.

[9]孙蓉，吕丽莉，郭守东，等.芍药苷对局灶性脑缺血模型及血脑屏障的影响[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2005,21(4)：405-410.

(编辑陶珠)

1001-6910(2015)03-0067-04

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