化瘀解毒益气法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠胃黏膜细胞PCNA水平和凋亡状况的干预研究*

彭继升，杨晋翔，安 静，魏 玥，贺梅娟

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029； 2.北京中医药大学，北京 100029)

·实验研究·

化瘀解毒益气法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠胃黏膜细胞PCNA水平和凋亡状况的干预研究*

彭继升1，杨晋翔1，安 静1，魏 玥1，贺梅娟2

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029； 2.北京中医药大学，北京 100029)

目的：观察以化瘀解毒益气法为治则的中药消痞颗粒对慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)伴异型增生大鼠胃黏膜细胞增殖和凋亡的影响。方法：以MNNG癌诱变剂灌胃为主多因素联合建立CAG伴Dys大鼠模型，按体质量随机分成自然恢复组、维酶素组与中药组，分别给予生理盐水、维酶素悬浊液、消痞颗粒灌胃，并与正常对照组大鼠对照。干预阶段持续12周，观察各组大鼠胃黏膜病理变化、免疫组化检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)水平、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定[terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL]法检测胃黏膜上皮细胞凋亡状况。结果：中药组治疗后与自然恢复组胃黏膜病理存在显著差异(P<0.05)，维酶素组与自然恢复组无明显差异(P>0.05)；消痞颗粒组凋亡指数显著低于自然恢复组和维酶素组(P<0.01,P<0.05)。自然恢复组和维酶素组间无显著性差异；消痞颗粒组PCNA表达的阳性比与维酶素组、自然恢复组间均存在显著差异(P<0.05,P<0.01)；而维酶素组与自然恢复组间并无显著性差异(P>0.05)。结论：消痞颗粒可改善CAG伴Dys大鼠胃黏膜的病理变化，降低其凋亡指数及PCNA表达。

化瘀解毒益气法；慢性萎缩性胃炎/药物作用；细胞增殖；细胞凋亡；消痞颗粒/治疗应用；动物模型，大鼠

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，一般认为胃癌的演变规律为：正常胃黏膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌(肠型)[1]。异型增生是目前公认的胃癌癌前病变，基本认为其病变是不可逆的，但阻断其继续向胃癌的发展，仍是目前防治胃癌的研究关键。胃黏膜细胞的增殖和凋亡失衡在慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)向胃癌发展过程中扮演着重要角色。前期研究[2]显示:中药消痞颗粒以化瘀解毒益气法为治则，对胃癌前病变有着确定的临床疗效，并可有效干预CAG伴不典型增生大鼠的抑癌基因。本实验主要通过免疫组化检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定[terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL]法检测胃黏膜上皮细胞凋亡状况，观察消痞颗粒对异型增生大鼠胃黏膜细胞增殖和凋亡状况的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体Wistar实验用雄性大鼠60只，4周龄，体质量约100 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物批号：SCXK(京)2012-0001。清洁级普通饲料、清洁级加药饲料(由普通饲料添加质量分数0.03%的盐酸雷尼替丁)均由北京科澳协力饲料有限公司提供。

1.2 药品、试剂与仪器

消痞颗粒剂由党参、炙百合、乌药、香橼皮、丹参、三七粉、莪术、蒲公英、白花蛇舌草组成，由北京中医药大学第三附属医院药剂科制成颗粒冲剂，12 g/袋，每克冲剂含生药9 g。根据实验需要配制成0.6 g/mL(含生药3 g/mL)的药液，装入器皿中，放置在4 ℃冰箱中以备用。维酶素片,河北环海药业有限公司产品，批号20090506；N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，日本东京化成工业株式会社产品，编号M0527；质量分数28%氨水，西陇化工有限公司产品，批号1503232，CAS登陆号1336-21-1，临用配制成质量分数0.5 g/L的氨水溶液。盐酸雷尼替丁胶囊，石药集团欧意药业有限公司产品，规格为0.15 g/粒，批号100902256。戊巴比妥钠，美国Sigma 公司产品，CAS登陆号57-33-0，货号P376，根据取材需要量配置成10 g/L溶液备用。PCNA (PC10) Mouse mAb，Cell Signaling Technology, Inc产品，产品编号2586s；细胞凋亡试剂盒(In Situ Cell Apoptosis Detction Kit I,POD)，产品编号11684817910，罗氏Roche产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

60只大鼠经适应性饲养1周，按体质量随机分为两组。正常对照组10只，以清洁级动物标准提供普通饲料喂养，持续至实验结束；造模组50只，如下述造模方法和饲养条件进行干预。模型的建立参照相关文献[3]及前期实验经验[4]，以MNNG癌诱变剂灌胃为主、多因素联合建立慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠模型。动物于实验动物室屏蔽环境下分笼饲养，每5只分为1笼，正常光照条件，明暗周期 12/12 h，室温(25±3)℃，相对湿度(50±5)%。模型组大鼠自由饮用质量分数为0.5 g/L氨水溶液(每24 h新鲜配制并更换1次)，自由进食质量分数0.3 g/L盐酸雷尼替丁清洁级大鼠饲料，予120 mg/L的MNNG溶液灌胃，每只5μL/(g·d)。于实验第20，24，26，28，30，32周末分别随机抽检2只动物。第32周末造模成功，造模结束。第33周始将造模组剩余的33只大鼠按体质量随机分成自然恢复组、维酶素组和消痞颗粒组3组，每组11只。以清洁级动物标准提供普通饲料和水。自然恢复组予生理盐水3 μL/(g·d)灌胃；维酶素组予维酶素悬浊液2 μL/(g·d)(即维酶素0.3 g/kg)灌胃；消痞颗粒组予消痞颗粒悬浊液3 μL/(g·d)(含生药9 g/kg)灌胃。干预阶段持续12周。所有实验大鼠于第44周末处死。

1.4 检测指标

1.4.1 取 材

于实验第44周末取材。取材前各组大鼠禁食不禁水18 h。以质量分数10g/L的戊巴比妥钠按30 μg/g经腹腔注射麻醉大鼠；迅速沿大弯侧剪开，40 g/L 生理盐水漂洗内容物；再沿小弯侧剪开；用滤纸吸干水分；切取病变胃黏膜组织，切取胃窦组织；甲醛固定，石蜡包埋，用于病理切片、免疫组化检测及TUNEL检测。

1.4.2 胃黏膜组织病理变化

采用常规HE染色，病理分析标准采用2000年全国慢性胃炎研讨会共识意见[5]和2006年全国慢性胃炎共识意见中的病理诊断标准[6]，分为正常、轻度、中度、重度4个等级。

1.4.3 细胞凋亡指数、PCNA蛋白表达

操作步骤参照张玲霞等[7]的报道。细胞核呈棕褐色着染或细胞浆因核 DNA逸出呈阳性着染者, 为凋亡细胞。每张切片观察5个视野, 每个视野计数100 个细胞核, 计数中凋亡细胞比率的均数为凋亡指数。采用免疫组化法检测。具体步骤：①常规脱蜡和水化。②抗原修复：0.1 mL/L Triton 浸润15 min(每片100 μL)；0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3；30 mL/L H2O2-CH3OH浸润10 min，0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3；微波抗原修复10 min，自然冷却到室温；0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3；加山羊血清浸润20 min；将山羊血清甩去，滴加Ⅰ抗(稀释200倍)，放于冰箱中，4 ℃过夜；从冰箱中将切片去除，在室温中放置30 min，0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3；滴加Ⅱ抗，在37 ℃的温度下浸润20 min，0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3。③显色：滴加SABC，在37 ℃的温度下浸润20 min，0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3；DAB显色10 min，镜下观察；自来水冲洗，ddH2O冲洗；苏木精复染1 s，0.01 mol/L PBS 浸润3 min×3。④脱水封片。免疫组化结果的判定标准：PCNA阳性染色为棕褐色颗粒。在高倍镜(×40)视野随机选取5个视野摄像，使用IPP7.0图像分析软件进行图像分析，并计算总面积内的平均光密度值，进行半定量分析。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠死亡情况

造模阶段：造模组大鼠共抽检12只，死亡5只；正常对照组大鼠无死亡。第16周造模组出现1只大鼠死亡，解剖后发现肺水肿，考虑为灌胃不当所致。造模组第24，28周各有1只大鼠分别于右下腋、右后颈项部出现皮下肿物，包膜完整，其中1只大鼠病理检查示类子宫内膜样组织；第30，32周各有1只大鼠死亡，肺部组织出现轻、中度感染，肺间质肺炎。

干预阶段：共43只大鼠进入干预阶段，自然恢复组、消痞颗粒组、维酶素组各11只，正常对照组10只。消痞颗粒组与正常对照组均无大鼠死亡，自然恢复组死亡3只，维酶素组死亡2只。5只大鼠死亡前体质量下降明显，腹胀明显，解剖结果示死亡由全胃肠道胀气所致，尤其回盲部明显；3只大鼠可闻及明显喘鸣音，口鼻处有血性或黏性分泌物，解剖后肺组织病理确诊肺部有感染，有大量炎性细胞浸润。

2.2 各组大鼠胃黏膜组织病理改变对比

造模阶段模型组：实验第20周，1只大鼠胃黏膜固有腺体上皮细胞出现核分裂象，判断出现异常增生，另一只大鼠未出现异型增生，继续实验的造模部分。实验第24周，胃窦部黏膜仅出现炎症反应，有少量以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润，余无明显异常病变。实验第26周末，模型组抽检大鼠胃黏膜除炎性细胞浸润外出现黏膜变薄，黏膜肌层增厚，固有腺体减少。实验第28周末，模型组抽检大鼠除胃黏膜慢性炎症反应、黏膜变薄及腺体减少外，出现肠上皮化生。实验第30周，1只大鼠病理切片示胃窦部出现异型增生，另1只大鼠胃窦部未出现异常增生。实验第32周，2只大鼠病理切片示胃窦部均出现异常增生。见图1。

实验第44周末，自然恢复组大鼠胃窦部及胃体底部黏膜上皮萎缩变薄，腺体数量减少，间质内有淋巴细胞浸润，偶见单核细胞、嗜酸性白细胞，可见淋巴滤泡形成和肠上皮化生，以及不同程度的异型增生，表现为细胞大小、形态不均一，结构不规整，核浆比例显著增大，出现核分裂，个别腺体呈共壁形象或囊性扩张，见图2。维酶素组大鼠胃窦部及胃体黏膜仍有淋巴细胞浸润，表现为程度不等的慢性浅表性、萎缩性胃炎等改变，较自然恢复模型组轻，见图3。消痞颗粒组大鼠胃窦部及体部黏膜上皮排列规整，腺体大小、形态较均一，偶有淋巴细胞浸润，见图4。正常对照组大鼠胃黏膜层厚度正常，胃黏膜上皮细胞呈单层柱状，胞浆透明或呈小空泡状，与腺管分界清楚，腺管结构排列整齐，大小、形状均一，见图5。

胃黏膜中、重度异型增生图1 实验第32周大鼠胃黏膜组织病理改变 (HE，×10)

胃窦部重度异型增生，腺体结构异常，腺体排列不整齐，有囊性扩张图2 实验第44周末自然恢复组大鼠胃黏膜组织病理改变(HE，×20)

胃黏膜腺体结构异常，腺体排列不整齐，轻度肠上皮化生，中度异型增生图3 实验第44周末维酶素组大鼠胃黏膜组织病理改变(HE，×4)

胃黏膜腺体增生不明显，有轻度炎症，胃黏膜接近正常图4 实验第44周末消痞颗粒组大鼠胃黏膜组织病理改变(HE，×10)

胃黏膜正常图5 实验第44周末正常对照组大鼠胃黏膜组织病理改变(HE，×20)

经统计学分析：正常对照组与其余各组病理情况对比，差别均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。消痞颗粒组与自然恢复组间差别有统计学意义(P<0.05)。维酶素组与自然恢复组间差别无统计学意义(P>0.05)。消痞颗粒组与维酶素组间差别亦无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组干预结束后阶段病理变化情况

表1 各组干预结束后阶段病理变化情况

组 别例数异型增生轻度中度重度合计正常对照组1000010自然恢复组12238∗∗维酶素组32229∗∗消痞颗粒组722011∗#

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与自然恢复组对比，#P<0.05

2.3 各组大鼠细胞凋亡指数对比

正常大鼠胃黏膜中，凋亡细胞主要位于表面上皮内，呈簇状分布或单个散在分布。自然恢复组、维酶素组凋亡细胞的阳性反应物质为棕黄色,位于细胞核内,浓缩的核质紧贴于核膜,或核质呈现均匀的染色。其余3组模型大鼠凋亡细胞数明显增多，高于正常对照组大鼠，差别有统计学意义(P<0.01)。消痞颗粒组凋亡指数也低于自然恢复组和维酶素组，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。自然恢复组和维酶素组间差别亦有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠细胞凋亡指数对比

表2 各组大鼠细胞凋亡指数对比

组 别动物数/只凋亡指数正常对照组100．065±0．010自然恢复组80．303±0．016∗∗∗维酶素组90．288±0．009∗∗∗##消痞颗粒组110．275±0．014∗∗∗###△△

注：与正常对照组对比，** *P<0.01；与自然恢复组对比，##P<0.05，###P<0.01；与维酶素组对比，△△P<0.05。

2.4 各组大鼠PCNA蛋白表达水平对比

各组大鼠胃黏膜均出现PCNA阳性显色。正常对照组黏膜阳性细胞较少，主要位于增殖带，分布规律，着色弱。模型组阳性细胞增多，全层均有表达，着色加深，不典型增生部位阳性细胞数明显增多。消痞颗粒组阳性细胞明显减少。经图像软件处理，定量分析显示：与正常对照组对比，其余3组大鼠PCNA蛋白表达增高，差别有统计意义(P<0.01)。消痞颗粒组PCNA蛋白表达水平较维酶素组、自然恢复组低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。维酶素组与自然恢复组间PCNA蛋白表达水平对比差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠PCNA蛋白表达水平对比

表3 各组大鼠PCNA蛋白表达水平对比

组 别动物数/只PCNA蛋白表达正常对照组100．150±0．011自然恢复组80．337±0．016∗∗∗维酶素组90．330±0．011∗∗∗#消痞颗粒组110．314±0．024∗∗∗###△△

注：与正常对照组对比，***P<0.01；与自然恢复组对比，#P>0.05,###P<0.01；与维酶素组对比，△△P<0.05。

3 讨 论

据调查，我国20世纪90年代胃癌死亡占恶性肿瘤死亡的23.2%，并且在过去的20年中，呈上升趋势[8]，因此，胃癌是目前肿瘤防治的重点。目前一般认为，胃癌是由癌前病变逐步发展形成的[9]，利用各种干预手段积极治疗癌前病变对防治胃癌的发生具有重要意义[10]。CAG是胃癌的癌前疾病，胃癌前病变是多因素、多阶段综合作用下，逐步缓慢进展的长期过程。长期慢性刺激、反复损伤导致慢性胃黏膜炎症反应，组织不断修复增生是形成胃癌前病变的充要条件。胃黏膜细胞的增殖和凋亡失衡在CAG向胃癌发展过程中扮演着重要角色。

维持胃黏膜的正常结构依赖于胃黏膜细胞丧失和更新的动态平衡。正常的细胞凋亡机制可以清除机体内受损、变异和衰老的细胞。研究表明,在从正常胃黏膜到萎缩性胃炎过程中,细胞凋亡指数及细胞增殖指数均呈递增趋势,细胞凋亡与细胞增殖呈正相关[11]。TUNEL法是检测细胞凋亡的常用方法，可对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种仅在增殖细胞中合成与表达的36 kD多肽。已证明PCNA表达与细胞增殖周期有关。G1期PCNA表达逐渐增加，S期达到高峰，而G2/M期减少[12]。检测PCNA指数对了解癌细胞的增殖状态有很高的价值，PCNA表达越强,细胞恶化程度越高[13]。

笔者认为萎缩性胃炎伴胃黏膜异型增生是毒、瘀、虚共同、长期积累的结果，尤其是毒致胃黏膜发生异型增生，因此，提出毒损胃络是胃黏膜异型增生的重要病机。笔者临床中应用这一理论辨证论治，发现对胃黏膜异型增生的逆转有理想的疗效[14-16]。消痞颗粒是笔者多年来研究的化瘀解毒益气的方剂，由党参、炙百合、乌药、香橼、丹参、三七、莪术、蒲公英、白花蛇舌草组成，可有效治疗萎缩性胃炎伴胃黏膜异型增生，逆转胃癌癌前病变[17]。本实验中消痞颗粒组大鼠胃黏膜细胞病理改变较维酶素组、自然恢复组为轻，图像分析示消痞颗粒组PCNA表达及凋亡指数均低于维酶素组及自然恢复组，表明消痞颗粒可有效地干预萎缩性胃炎病变大鼠的胃黏膜细胞增殖和凋亡状况。此为消痞颗粒有效阻止萎缩性胃炎向癌变发生提供了一定理论支持。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0049-05

R573.3+2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.26

彭继升(1980-)，男(汉族)，山东聊城人，北京中医药大学第三附属医院脾胃病科副主任医师，博士，主要从事消化代谢疾病的中医药防治。

2012年北京中医药大学青年教师专项计划(2012-QNJSZX024)

2014-09-11；

2015-01-05