大剂量岷县当归预处理对心肌缺血再灌注大鼠NO、NF-κB的影响*

陈彦文，明海霞，王 强，郭 超，赵 英，高晓兰

(1.甘肃中医学院解剖教研室,甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医学院生理教研室，甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

大剂量岷县当归预处理对心肌缺血再灌注大鼠NO、NF-κB的影响*

陈彦文1，明海霞2，王 强1，郭 超1，赵 英1，高晓兰1

(1.甘肃中医学院解剖教研室,甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医学院生理教研室，甘肃 兰州 730000)

目的:观察大剂量岷县当归水煎液预处理对缺血-再灌注大鼠心肌组织NO、NOS含量及心肌细胞NF-κB、IκB-α表达的影响作用。方法:以不同大剂量岷县当归水煎液灌胃6周后，取大鼠心脏进行离体灌注，复制当归缺血预适应模型，以化学法测定上清液中NO、NOS含量，SP免疫组化检测心肌细胞NF-κB、IκB-α的表达。结果: 与缺血预适应组对比，中、高剂量岷县当归水煎液预处理组NO、NOS含量均显著增高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量-效应关系。与缺血预适应组对比，中、高剂量当归水煎液预处理组NF-κB在胞浆和胞核中的表达均有不同程度减少，IκB-α表达相应增加，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。 结论:大剂量岷县当归水煎液预处理可通过提高缺血-再灌注大鼠心肌组织NO含量、抑制NF-κB表达来保护缺血-再灌注大鼠的心肌细胞。

岷县当归水煎液/药效学；缺血-再灌注/药物作用；细胞凋亡；NO；NOS；NF-κB；IκB-α；动物模型，大鼠

心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemia-reperfusion injury，IR)是心肺复苏、心肌梗死溶栓和介入治疗，以及心脏移植中的重要病理生理过程。缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。水煎口服是中医临床常用给药途径。我们前期研究表明，大剂量岷当归水煎液预适应可减少或防止大鼠心肌缺血-再灌注室性心律失常的发生[1]。NF-κB是一种普遍存在的具有基因转录多向调控作用的转录因子，其转录调节的连结位点位于许多促炎细胞因子与免疫调节因子的启动区，主要介导炎症反应、细胞增殖及细胞凋亡等生物反应，在心肌缺血/再灌注损伤中发挥着重要作用。本实验通过研究大剂量岷县当归水煎液预防性给药对缺血-再灌注大鼠心肌组织NO含量和NF-κB表达的影响作用，进一步探讨大剂量岷县当归对缺血性心肌损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级健康成年雄性SD大鼠48只，体质量(200±20)g，由甘肃中医学院科研实验中心实验动室提供，实验设施使用证为SYXK(甘)2009～0006，实验动物质量合格证为SCXK(甘)2009～0006。

1.2 药品与试剂

岷县当归药材，兰州复兴厚药材有限公司提供，经鉴定符合药典规定；岷县当归水煎液采用常规煎煮方法制备，浓缩为1g/mL。核因子-κB( NF-κB)试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司提供，批号990188W；核因子抑制性蛋白(IκB-α)试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司提供，批号990991W；二抗兔 SP检测试剂盒，北京中山金桥生物技术有限公司提供，批号921437A；NO、NOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号20110215。

1.3 动物分组与模型的建立

麻醉大鼠同时，腹腔注射肝素，然后随机分为6组，每组8只。开胸取心脏置于冷灌流液中，主动脉逆行插管连接在Langendorff 离体灌流装置上，以80 mm H2O 的压力Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(KH)[(NaCl 118.5，NaHCO325.0，KH2PO41.2，KCl 4.8，MgSO41.2，CaCl222.0，葡萄糖1.0)mmol/L]灌流心脏，用体积分数950 mL/L O2和50 mL /L CO2混合气体平衡灌流液。

①空白对照组：以80 mm H2O的压力KH缓冲液灌流心脏，用体积分数950 mL/L O2和50 mL /L CO2混合气体平衡灌流液进行平衡灌流，不进行缺血与缺氧处理。②缺血/再灌注组：大鼠心脏先预灌注平衡 20 min，然后在无灌流液、无氧的条件下，保持心脏温度恒定在37 ℃，停止灌流40 min(缺血)，之后再复灌120 min(再灌)。③缺血预适应组：大鼠心脏先预灌注平衡 20 min ，再经短暂的5 min缺血，10 min再灌注，重复3次之后，心脏再经历40 min的缺血、120 min的再灌注。④当归小剂量水煎液+缺血预适应组、当归中剂量水煎液+缺血预适应组和当归大剂量水煎液+缺血预适应组：依次给予大鼠当归小(0.54 g/d)、中(1.08 g/d)、大剂量(2.16 g/d)水煎液灌胃，依次相当于人剂量的30，60，120 g。给药6 周后，麻醉动物，迅速取心脏连接到离体心脏灌流装置上，复制心脏IPC 模型，复制方法同缺血预适应组。除当归各组外，其余3组于实验前均以等量生理盐水灌胃。

1.4 检测指标

1.4.1 心肌组织NO、NOS含量

实验结束后，在同一部位取心肌组织约 200 mg，吸干水渍后置入液氮保存。测定前称量质量，剪取100 mg左右心肌组织块，研磨成100 g/L匀浆，低温离心，取上清液，以化学法测定上清液中NO、NOS含量。

1.4.2 心肌细胞NF-κB、IκB-α表达

取各组心肌组织制作石蜡组织切片，SP免疫组化染色严格按试剂盒说明书进行，即于石蜡组织切片上滴加1∶100的抗NF-κBp65抗体(一抗，以PBS代替一抗作为阴性对照)，4 ℃过夜,以PBS洗涤后，滴加生物素标记的山羊抗兔的二抗工作液,加DAB显色后，再以苏木素衬染，中性树胶封片并摄像。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌NO、NOS含量对比

与空白对照组对比，缺血/再灌注组NO、NOS含量均显著下降，差别有统计学意义(P<0.05)。与缺血/再灌注组相比，缺血预适应组NO、NOS含量均显著增高，差别有统计学意义(P<0.05)。与缺血预适应组对比， 中、高剂量岷县当归预处理组NO、NOS含量均增高(P<0.05或P<0.01)，且呈显著的剂量-效应关系，低剂量组则不明显。见表1。

表1 各组大鼠心肌NO、NOS含量对比

表1 各组大鼠心肌NO、NOS含量对比

组 别剂量/(g·d-1)NO/(μmol·g-1)NOS/(IU·mg-1)空白对照组-7．48±1．670．85±0．20缺血/再灌注组-3．41±0．41∗0．32±0．08∗缺血预适应组-4．87±0．62#0．48±0．12#当归小剂量水煎液+缺血预适应组0．544．75±0．830．50±0．15当归中剂量水煎液+缺血预适应组1．085．66±1．06△0．60±0．18△当归高剂量水煎液+缺血预适应组2．166．56±1．08△△0．72±0．17△△

注：与空白对照组对比： *P<0.05；与缺血/再灌注组对比，#P<0.05；与缺血预适应组对比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各组大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α阳性表达对比

表达阳性者，在心肌细胞的胞浆和/或胞核中可见棕黄色或棕黄色颗粒。用图像分析仪分别测量每张切片中NF-κB阳性细胞和IκB-α阳性细胞的平均吸光度值作为其相对的表达量。缺血/再灌注组NF-κB+于胞浆和胞核中均有明显表达， 缺血预适应组NF-κB在胞浆和胞核中的表达减少，IκB-α表达增加，差别有统计学意义(P<0.05) 。与缺血预适应组对比，中、高剂量当归预处理组NF-κB在胞浆和胞核中的表达均有不同程度减少，IκB-α表达相应增加，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，低剂量组则不明显。见表2、图1、图2。

表2 各组大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α阳性表达的平均吸光度值对比

表2 各组大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α阳性表达的平均吸光度值对比

组 别剂量/(g·d-1)NF⁃κBIκB⁃α空白对照组-0．216±0．0500．677±0．120缺血/再灌注组-0．636±0．116∗0．302±0．100∗缺血预适应组-0．458±0．107#0．447±0．103#当归小剂量水煎液+缺血预适应组0．540．446±0．1040．488±0．108当归中剂量水煎液+缺血预适应组1．080．304±0．100△0．598±0．113△当归高剂量水煎液+缺血预适应组2．160．282±0．098△0．614±0．115△

注：与空白对照组对比：*P<0.05；与缺血/再灌注组对比，#P<0.05；与缺血预适应组对比，△P<0.05。

图1 心肌细胞NF-κB阳性细胞表达情况(免疫组化SP法染色，×200)

图2 心肌细胞IκB-α阳性细胞表达情况(免疫组化SP法染色，×200)

3 讨 论

当归有多种心血管药理作用，临床可用于缺血性心脏病的治疗。中药汤剂是临床中药应用的主要形式，剂量是影响中药汤剂功效方向发挥的重要因素。在《中国药典》中当归汤剂的用量规定为6～12 g[2]，临床实践表明：当归小剂量应用则补血，大剂量应用则活血[3]。活血是当归防治缺血性心肌疾病的主要中药功效基础。前期研究[1-2]表明：大剂量岷县当归水煎液预处理可减少或防止大鼠心肌缺血-再灌注室性心律失常的发生，可增加心肌组织Bcl-2的表达而抑制Bax的表达，从而减少缺血-再灌注大鼠心肌细胞的凋亡，对缺血-再灌注大鼠心肌具有明显保护作用。

NF-κB是一种广泛存在的转录因子，在静息情况下，以同源二聚体形式存在于胞质中，并与抑制性蛋白IκB结合呈无活性状态。离体工作心脏模型可以观察到，心脏单纯性短暂缺血即可引起NF-κB活性显著升高，短暂再灌注即可进一步升高NF-κB活性，说明IR可激活NF-κB 。NF-κB是心脏应激反应快速表达基因，可引起某些细胞因子、黏附分子的过度表达，从而在IR过程中发挥关键性作用[4]。有研究证实：抑制NF-κB的转录，可减少IL-1和TNF-α等促炎症因子的表达，从而表现出明显的抗炎活性[5]。因此，通过抑制NF-κB的活化或者降低NF-κB的活性，可以下调促炎因子的表达，降低心肌细胞凋亡数量，促进IR后心功能的恢复[6]。

NO是一种很强的舒血管物质，可扩张冠状动脉，改善微循环；抑制中性粒细胞趋化、聚集与黏附，对血管内皮细胞具有重要保护作用。在基础状态下，血管内皮细胞生成的NO对调节冠状动脉基础张力和心肌血流灌注有重要作用。内源性NO生成减少，可激活NF-κB活性[7]，说明内源性NO的抗炎活性、心肌保护作用与NF-κB有一定的相关性。

本研究结果证实：以大剂量岷县当归水煎液预处理，可明显增加缺血再灌注大鼠NO含量，上调IκB表达，从而抑制NF-κB的活化或降低NF-κB的活性，尤其以相当于人剂量的120g的大剂量当归水煎液较为显著。此表明：大剂量岷县当归可能通过药物调节机体内源性物质生成而发挥心肌保护作用。

[1]陈彦文，明海霞，王强，等.岷县当归预适应对大鼠缺血-再灌注心律失常的影响[J].西部中医药，2013，18(2)：15-17.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化学工业出版社，2005.

[3]仝小林.重剂起沉疴 [M].1版，北京：人民卫生出版社，2010：536.

[4]Rizk NN，Myatt-Jones J，Rafols J，et al.Insulin like growth factor-l(IGF-l)decreases ischemia-reperfusion induced apoptosis and necrosis in diabetic rats[J].Endocrine，2007，31(1)：66-71.

[5]Lee JW, Bae CJ, Choi YJ，et al.3,4,5-Trihydroxycinnamic acid inhibits LPS-induced iNOS expression by suppressing NF-κB activation in BV2 Microglial Cells[J].Korean J Physiol Pharmacol，2012，16 (2)：107-112.

[6]冯睿章，党万太.心肌缺血/再灌注损伤与细胞内多信号转导通路的研究进展[J].四川生理科学杂志，2012，34(1)：32-34.

[7]姜美燕，朱大年.一氧化氮在心肌缺血中的作用及其机制新进展[J].医学研究杂志，2008，37(2)：19-20.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0053-04

R541.6

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.27

陈彦文(1969-)，男(汉族)，甘肃陇南人，学士，副教授，主要研究方向为中西结合防治心脑血管疾病基础研究。

明海霞，副教授， 18909429885@163.com

甘肃省教育厅基金项目(044B-03)

2014-10-22；

2015-03-17