滋肾补骨法对左氧氟沙星致幼鼠软骨厚度损伤的修复作用*

潘海邦，吴国泰，王 波，张志明

(1.甘肃中医学院, 甘肃 兰州 73000 ; 2.甘肃中医学院附属医院, 甘肃 兰州 73000)

·实验研究·

滋肾补骨法对左氧氟沙星致幼鼠软骨厚度损伤的修复作用*

潘海邦1，吴国泰1，王 波1，张志明2

(1.甘肃中医学院, 甘肃 兰州 73000 ; 2.甘肃中医学院附属医院, 甘肃 兰州 73000)

目的：探讨中医滋肾补骨理论对喹诺酮类药物所致幼年机体软骨损伤的保护作用。方法：将健康幼龄(4周龄)wistar大鼠72只随机分为正常对照组、模型对照组、怀牛膝组、山茱萸组、蛇床子组、怀牛膝+山茱萸、怀牛膝+蛇床子组、山茱萸+蛇床子组、怀牛膝+山茱萸+蛇床子组9组。建立左氧氟沙星诱导幼龄大鼠软骨损伤模型，采用具有补肾功效的中药牛膝、山茱萸和蛇床子,按L8(27)正交设计灌胃给药，14d后取膝关节软骨病理切片并测量软骨厚度。结果：正常对照组软骨厚度(190.13±12.43)μm，模型对照组(124.50±12.01)μm，中药治疗组软骨厚度 (156.50～180.00)±(10.89～15.09)μm，各中药治疗组软骨厚度变薄程度明显轻于模型对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。光镜下，各中药及配伍组软骨厚度亦处于正常对照组与模型对照组之间。结论：滋肾补骨法对喹诺酮类药物所致幼年机体软骨损伤具有保护作用。

滋肾补骨法；左氧氟沙星；软骨厚度/保护作用；动物模型；大鼠

喹诺酮类药物疗效确切，交叉耐药性相对较低，过敏反应少见，加之价格低廉，是临床常用药物，但其对幼龄机体软骨有损伤作用，从而导致该类药物在妊娠期、哺乳期女性及儿童中应用受到限制。中医常用补肾法治疗各类关节软骨疾病，并取得了好的成效[1-6]，检索常用药物有淫羊藿、山茱萸、蛇床子、怀牛膝、补骨脂等，但应用中药防治喹诺酮类药物所致软骨损伤的相关研究甚少。本研究通过正交设计探讨了补肾中药怀牛膝、山茱萸和蛇床子对左氧氟沙星所致幼龄大鼠软骨损伤模型膝关节厚度的影响。

1 材料与方法

1.1 正交设计

本实验设3个单药因素及其配伍，每个因素设置2个水平，按照L8(27)正交试验表设计实验组别。

表1 因素及水平表

1.2 动 物

SPF级健康幼龄(4周龄)Wistar大鼠72只，雌雄各半，体质量(50.00±8.02)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：0001115。自由进食、饮水。

1.3 药品、试剂与仪器

怀牛膝、山茱萸、蛇床子中药材，均购自甘肃中医学院附属医院中药房，经甘肃中医学院附属医院杨锡仓主任中药师鉴定。三者按成人18g/d剂量给药，等效剂量换算。剂量为1.5g/kg，容积为10μL/g，18g/60kg×10(倍)=3g；3g/10mL=150g/500mL。第1煎：将150g药材加900mL蒸馏水，煎40min，取滤液。第2煎：药渣加450mL蒸馏水，煎30min，取滤液。合并两煎滤液，浓缩成500mL，按10μL/g体质量灌胃。盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液，地奥集团成都药业股份有限公司产品，批号F13051905-2。Olympus生物光学显微镜，产地日本；H.H.S21-4型电热恒温水浴箱， 上海医疗器械五厂产品；AO-82型转轮切片机、AO-940型自动磨刀机，产地美国；800型离心沉淀器，上海手术器械十厂产品；101型电热恒温干燥箱，北京科伟永鑫实验仪器设备厂产品；MiE图像系统，山东易创电子有限公司产品；VORTEX-5型涡旋器，购自汕头市澄海区立丰检测仪器店；H1650-W型高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.4 动物分组、模型的建立与给药

将72只大鼠随机分成9组，每组8只，分别为：正常对照组、模型对照组、怀牛膝组、山茱萸组、蛇床子组、怀牛膝+山茱萸组、怀牛膝+蛇床子组、山茱萸+蛇床子组、怀牛膝+山茱萸+蛇床子组。造模方法参照文献[7-8]方法：除正常对照组外，其余各组大鼠均腹腔注射盐酸左氧氟沙星注射液40μg/g，正常对照组腹腔注射等容量的9g/L的生理盐水，1d1次，连续21d，观察并记录大鼠的活动量、皮毛色泽、饮食和排便等一般情况，每周称量体质量1次。第8天开始，除模型对照组、正常对照组外，其余各组大鼠灌胃中药，1d1次，连续14d。中药怀牛膝、山茱萸、蛇床子按成人18g/d剂量给药，等效剂量换算，剂量1.5g/kg，按10μL/g体质量灌胃。正常对照组和模型对照组不给中药。

1.5 检测指标

1.5.1 标本采集

末次灌完中药4h后，取血并脱颈椎处死大鼠，迅速剪开膝关节处的皮肤及肌肉，暴露并剪下膝关节，左侧膝关节置40g/L甲醛溶液中固定；48h后以蒸馏水清洗，再以质量分数50g/L硝酸溶液脱钙10d；将标本以石蜡包埋，用转轮切片机垂直于关节软骨面将组织切片，切片厚度为8μm，然后行HE常规染色。

1.5.2 膝关节软骨厚度

使用带刻度Olympus显微镜进行手工测量，每组随机取3张HE染色切片(切片从胫骨外侧髁切取，垂直于软骨方向)，每张切片从最厚到最薄平均取6个不同的厚度进行测量，测量从软骨表面到钙化层的厚度，结果用微米(μm)表示。由两位中级以上职称评分者分别对切片进行盲评，取平均值。

HE染色完毕，以中性树胶封片，以生物光学显微镜在4倍、40倍下观察膝关节软骨病理改变，并测量厚度。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠膝关节软骨厚度对比

见表2。

表2 各组大鼠膝关节软骨厚度对比

注：蛇床子组、怀牛膝+山茱萸组各有1只动物不明原因死亡。

2.2 膝关节软骨厚度正交试验

见表3。

表3 L8(27)正交试验表

分析：A1=124.5+160.25+123.88+181=589.63A2=180+156.75+176.13+156.5=669.38A2>A1，提示A有效。B1=124.5+160.25+180+156.75=621.5B2=123.88+181+176.13+156.5=637.51B2>B1，提示B有效。C1=124.5+123.88+180+176.13=604.51C2=160.25+181+156.75+156.5=654.5C2>C1，提示C有效。

由表4可见：A因素和C因素都有统计意义，B因素没有统计意义，A和C的交互有统计学意义。

分析A和C交互:

A1C1=124.5+123.88=248.38

表4 正交设计方差分析结果表

A2C1=180+176.13=356.13

A1C2=160.25+181=341.25

A2C2=156.75+156.5=313.25

可见A2C1最大，说明只用A药(怀牛膝)时软骨厚度最大。

2.3 光镜下膝关节软骨厚度

正常对照组：软骨层形态正常，切片染色均匀，组织学分层清晰，结构正常，厚度较厚(图1)。模型对照组：软骨层可见明显变薄，表面不规则，可见裂隙、中断，软骨细胞数量减少、排列紊乱(图2)。各中药及配伍组软骨厚度处于两者之间(图3～6)。

图1 正常对照组(HE，×40) 图2 模型对照组(HE，×40) 图3 怀牛膝组(HE，×40)

图4 山茱萸组(HE，×40) 图5 怀牛膝+蛇床子组(HE，×40) 图6 蛇床子组(HE，×40)

3 讨 论

喹诺酮类药物可致幼龄机体关节软骨损伤，引起软骨病理形态学改变。现2010版《中国药典》二部明确规定其为未成年人慎用或禁用药物。有研究表明：左氧氟沙星可增强兔膝关节前交叉韧带细胞的凋亡，增加基质金属蛋白酶3(MMP-3)mRNA和活化的caspase-3的表达[9]，对体外培养的兔关节半月板细胞具有毒性作用[10]，可致体外兔关节成纤维细胞及前十字交叉韧带细胞明显减少[11-12]。中医学认为：软骨损伤以肾精亏虚为主，肝血不足为次，治疗当以补肝肾强筋骨为主，辅以补益气血。现代药理研究表明：补肾是抗衰老的一种重要手段，它可以改善微循环，防止自由基过量产生，调节内分泌状态，增强免疫功能，保持骨量的稳定，抑制因性激素水平下降而导致的骨结构改变，使关节软骨退变和骨端松质骨囊肿样变等表现得到明显改善和修复[13-14]。怀牛膝性平，有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行等作用。牛膝的醇提物可以增加骨小梁密度、面积、总体积及密质骨面积，减小骨髓腔面积，阻止大鼠骨矿质的丢失[15]。牛膝多糖能够改善周围软组织肿胀情况，缩小关节面的变化及减轻骨赘情况的发生，增加膝关节屈伸最大角度，改善膝关节活动度，从而有利于骨性关节炎的修复[16]。山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱的作用。山茱萸水提物能明显改善SAM-P/6小鼠的骨质疏松状况，显著增加骨皮质厚度，增加SAM-P/6小鼠的抗疲劳能力，提高小鼠骨钙、骨磷的含量，抑制骨吸收，并能明显提高骨密度[17]。蛇床子补肾壮阳，蛇床子总香豆素对使用糖皮质激素和切除卵巢造成的骨质疏松症模型具有明显治疗作用[18-20]，可通过抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能进而起到对骨的保护作用[18]。

本实验采用4周龄大鼠腹腔注射左氧氟沙星40μg/g制作模型，用药后见不同程度软骨损伤，光镜下软骨层可见明显变薄、软骨基质疏松、组织学分级Mankin评分增高，出现文献报道软骨损伤形态改变[21-23]。软骨厚度可作为评价软骨损伤的一个指标[24]。本实验中模型动物组软骨厚度较正常对照组明显变薄，提示左氧氟沙星存在致幼年机体软骨损伤的毒副作用。予滋肾补骨中药干预后，各组软骨厚度均较模型对照组增厚，除山茱萸组外，差别均有统计学意义(P<0.05)，证明滋肾补骨中药对左氧氟沙星所致软骨损害有不同程度的保护作用。怀牛膝和蛇床子单用或配伍修复作用明显，进一步正交结果分析显示，怀牛膝单用对软骨厚度修复作用最佳。本研究所选怀牛膝、山茱萸和蛇床子均有补肾功效，但怀牛膝偏重活血化瘀，山茱萸偏重滋肾阴，蛇床子偏重补肾阳。根据实验结果，怀牛膝与蛇床子对软骨损伤均有保护作用，而山茱萸无统计学意义，提示喹诺酮类药物所致软骨损伤的病机可能更倾向于阳虚型，故山茱萸滋阴的功效得不到较好地显现。怀牛膝单用较与其他药配伍对软骨厚度修复作用更好，提示喹诺酮致软骨损伤的机制可能是药物作用于纯阳之身的幼年机体后使肾气损伤，致肾阳不足为主要临床证型，进而气滞血瘀。另外，喹诺酮所致幼龄大鼠软骨损害，病程一般较短，常以急性损害为主，急性损伤易致阳气损伤，而慢性疾病常伤阴气，此观点也支持喹诺酮所致软骨损伤多为肾阳虚为主要证型的推断。本实验为临床干预治疗选方择药提供了方向。补肾中药怀牛膝、蛇床子单用及配合使用对左氧氟沙星所致幼龄大鼠软骨损伤均有效，两药合用效果不及单用，由此推测可能与两种药物中所含某些有效成分及药物间配伍有关，此需做进一步研究。两药均有温补肾阳作用，但合用效果并未加强，分析也可能为补之太过。临证时当考虑两者配伍，发挥温阳活血功效，但需注意机体主要证候及药物用量。本实验中3药联合运用也未明显增强治疗效果，有时效果不及单药或双药联合运用，提示：临床辨证论治重在选药合理，盲目增加药物数量不一定加强治疗作用。此外，不同比例也可能产生不同效果。总之，滋肾补骨法对喹诺酮药物所致幼年机体软骨损伤具有保护意义。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0060-04

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.29

潘海邦(1975-)，男(汉族)，甘肃康县人，副教授，副主任医师，主要从事中西医结合基础及外科临床研究。

张志明，主任医师，zhangzhimingys@163.com

甘肃中医学院中青年科研基金项目(09ZQ-19)

2014-07-24；

2014-12-04