大黄牡丹汤组方对急性胰腺炎大鼠的保护作用*

张艳霞，张延英，舒 畅，蔡 兴，吴建军，李存祥，康万荣

(1.甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省分析测试中心,甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

大黄牡丹汤组方对急性胰腺炎大鼠的保护作用*

张艳霞1，张延英1，舒 畅1，蔡 兴2，吴建军1，李存祥1，康万荣1

(1.甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省分析测试中心,甘肃 兰州 730000)

目的：探讨大黄牡丹汤组方对急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)大鼠胰腺、肝脏、肾脏功能的保护作用及其可能的作用机制。方法：取40只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、模型对照组(以0.1mL/min的速度，经十二指肠壁浆肌层穿刺距离胆胰管开口0.3mm处的胆管，加压注射质量分数35g/L的牛磺胆酸钠1μL/g)、假手术组(开腹后轻牵引、翻动胰腹、十二指肠和胰胆管)及大黄牡丹汤治疗组(大黄牡丹汤 40g/kg灌胃给药)，每组10只。造模后24h，处死各组大鼠并立即心脏取血。采用ELISA法检测血清白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淀粉酶含量，用生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆红素(TBiL)含量，用免疫组化法检测胰腺、肝脏组织核因子-κB(NF-κB)P56蛋白表达的情况。结果：与模型对照组对比，大黄牡丹汤组血清IL-10含量增高，血清TNF-α含量下降，差别有统计学意义(P<0.01)，ALT、AST、TBiL、BUN、Cr降低，差别有统计学意义(P<0.01)，胰腺、肝脏组织内NF-κBP56的表达均减少(P<0.01)。结论：大黄牡丹汤可改善AP时的胰腺、肝脏病变及肝、肾功能，其作用机制可能与促进IL-10表达、抑制NF-κBP56和TNF-α的表达有关。

大黄牡丹汤/药效学；急性胰腺炎/药物作用；肿瘤坏死因子-α；白介素-10；NF-κBP56；动物模型；大鼠

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是临床常见的一种急腹症，并发症多[1]，死亡率高，发病过程复杂，是多种因素互相作用、互相影响的病理生理过程，具体机制至今尚不明确。近年来，随着对细胞因子研究的深入，有学者认识到细胞因子的过度释放是导致AP病情加重的主要根源[2]，因此如何阻止炎症细胞因子对机体的危害成为研究的主要方向。本课题考察在AP情况下大黄牡丹汤对白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)、核因子-κB(nuclearfactorκB，NF-κB)的影响及对胰腺、肝脏、肾脏等功能的影响，探索大黄牡丹汤能否对AP时的胰腺、肝脏组织起到保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180～220g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(甘)2011-0001，使用许可证号为SYXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

大黄牡丹汤，由甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室制成质量分数为4kg/L的药液。IL-10(批号2012102402)、TNF-α(批号2011050308)、淀粉酶试剂盒(批号20121202)及牛磺胆酸钠(批号20120805)，均购自兰州达硕生物有限公司；NF-κBP56抗体，购自SantaCruzBiotechnology公司，批号20120704。BenchmarkPlus连续波长酶标仪，美国伯乐公司产品；ALCYON300全自动生化分析仪，美国雅培公司产品。

1.3 动物分组与模型的建立

将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型对照组和大黄牡丹汤组4组，每组10只。模型对照组和大黄牡丹汤组大鼠禁食、自由饮水12h后，以质量分数30g/L戊巴比妥麻醉，打开腹腔，找到胆胰管，在其近端和远端均以动脉夹或1号丝线暂时结扎，将带有4号针头的1mL注射器沿十二指肠壁浆肌层穿刺距离胆胰管开口0.3mm处的胆管，注入质量分数35g/L的牛磺胆酸钠1μL/g，以0.1mL/min的速度注射完毕，停留5min，去除结扎线，指压穿刺点，查无漏胆，逐层关腹[3]。假手术组大鼠在开腹后仅轻轻牵引、翻动胰腺、十二指肠和胰胆管，然后关腹。所有动物术后禁食，清醒后自由饮水。

1.4 动物给药

建立模型后立即灌胃，大黄牡丹汤组于造模后30min给予大黄牡丹汤灌胃治疗1次，剂量为40g/kg(10μL/g)；正常对照组、模型对照组和假手术组灌胃等量的生理盐水。

1.5 检测指标

1.5.1 血清IL-10、TNF-α

大鼠造模24h后，处死各组大鼠，并立即心脏取血，分离血清，采用ELISA法检测血清IL-10、TNF-α、淀粉酶的含量，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 肝、肾功能

心脏取血，分离血清[4]，用生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆红素(TBiL)含量。

1.5.3 胰腺、肝脏组织NF-κBP56

处死大鼠后迅速切取病变较为明显的胰腺和肝脏组织，以体积分数4%的甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化法检测大鼠胰腺及肝脏组织中的NF-κBP56蛋白表达情况。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠血清IL-10、TNF-α和淀粉酶含量对比

与模型对照组对比，大黄牡丹汤组大鼠的血清IL-10含量增高，TNF-α、淀粉酶含量降低，差别有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-10 、TNF-α和淀粉酶含量对比

注：与模型对照组对比，** P<0.01；与正常对照组对比，## P<0.01。

2.2 各组大鼠肝、肾功能指标对比

与模型对照组对比，大黄牡丹汤组大鼠的血清ALT、AST、TBiL、BUN、Cr降低，差别有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠肝、肾功能指标对比

注：与模型对照组对比，** P<0.01；与正常对照组对比，# P<0.05，## P<0.01。

2.3 各组大鼠胰腺、肝脏组织NF-κBP56表达对比

与模型对照组对比，大黄牡丹汤组大鼠的胰腺、肝脏组织NF-κBP56的表达均减少，差别有统计学意义(P<0.01)。见表3。

注：与模型对照组对比，** P<0.01；与正常对照组对比，## P<0.01。

3 讨 论

急性胰腺炎无论病因如何，最终都会产生局部和全身炎性反应，与炎性因子的过度生成有关[5]。参与炎症反应的细胞因子包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子[6]。多种炎性因子发生瀑布样级联反应，引起AP炎症扩散，导致全身炎性反应综合征、多器官功能障碍以致死亡。与AP发生有关的炎性因子包括IL、TNF-α、NF-κB等，它们之间相互关联、相互影响。TNF-α是体内重要的促炎细胞因子，由激活的巨噬细胞、淋巴细胞分泌，其升高可诱导IL-6、IL-8及其自身表达的增高[7]，从而引起级联反应造成炎症介质的失控性释放；但同时机体亦存在自我清除机制，随着时间的推移，TNF-α的含量可下降[8]。IL-10是体内重要的抗炎细胞因子，主要由Th-2细胞产生，具有潜在的抗炎症功能，能抑制IL-2、IL-3和TNF-α等细胞因子的合成，对AP所致的多器官损伤有保护作用[9]。NF-κB是以同或异二聚体形式存在的核转录因子[10]。NF-κB活化状态可向核内转移，调控基因的转录和表达，其表达产物如炎症细胞因子参与了炎症反应。因此，NF-κB活化是调控炎症反应的关键[11]。与AP关系较密切的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的基因启动子都有NF-κB的结合位点，因此其表达在基因水平上受到NF-κB的调控，通过抑制NF-κB可以在整体水平上减少促炎因子的表达[12]。炎症调节机制具有网络性，TNF-α的产生受NF-κB调控，而其释放增加又促进NF-κB的激活，延续炎症反应的复杂环路调节，导致最初的炎症信号不断放大，这是一类正反馈。 在促炎因子激活的同时，IL-10等抗炎因子也被激活，抑制促炎因子的产生和释放，比如IL-10可抑制NF-κB的激活，这是一类负反馈。

本研究结果表明:大黄牡丹汤可改善AP时胰腺、肝脏组织病变及肝、肾功能，其机制可能与促进IL-10表达、抑制TNF-α及NF-κBp56蛋白表达有关。此外，与模型对照组对比，大黄牡丹汤组大鼠的血清ALT、AST、TBiL、BUN、Cr显著减低，说明大黄牡丹汤对AP状态下的大鼠肝脏、肾脏功能有一定的保护作用。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0055-04

R657.5+

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.27

张延英，硕士，副教授，780005161@qq.com

甘肃省技术研究与开发专项(1305TCYA043)

2014-09-11；

2014-11-04

张艳霞(1981- )，女(汉族)，甘肃白银人,硕士，讲师,主要从事新药药理学研究。