裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果比较

吴媛，周训钊，钟昌桃，颜魁，韦正波，谢莹(广西医科大学研究生学院，南宁500;广西医科大学附属肿瘤医院; 广西医科大学医学科学实验中心)

裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果比较

吴媛1，周训钊1，钟昌桃1，颜魁1，韦正波2，谢莹3
(1广西医科大学研究生学院，南宁530021;2广西医科大学附属肿瘤医院; 3广西医科大学医学科学实验中心)

摘要:目的比较裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果。方法制备鼻咽癌HONE-1细胞裸鼠皮下移植瘤块样本。将8只BALB/c裸鼠随机分为A、B组，各4只。A、B组分别使用皮肤切开缝合接种和穿刺套针接种方法于裸鼠右侧腋下接种细胞株移植瘤组织块，比较两组裸鼠肿瘤出现时间、体积、质量。结果A、B组肿瘤出现时间均为接种后第3天。与B组相比，A组裸鼠较早出现精神萎靡、皮肤粗糙、毛发光泽不良、食欲不振、活动量减低、脊椎明显、弓背等状况。两组裸鼠体质量均有所下降，A组比B组肿瘤生长迅速，但差异无统计学意义。A、B组肿瘤质量分别为(0.85±0.39)、(0.75±0.30) g，两组比较，P＞0.05。结论裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞均能达到好的成瘤效果。

关键词:鼻咽肿瘤;动物试验模型;成瘤;皮肤切开缝合接种;穿刺套针注射接种

鼻咽癌是在中国南方尤其两广地区常见的恶性肿瘤［1］。鼻咽癌临床样本裸鼠移植瘤模型的构建有利于其发生发展机制的研究，并为鼻咽癌的综合治疗提供良好的动物研究平台。然而，鼻咽癌本身的临床特征使获取的组织样本量较少，严重影响了移植瘤的存活率，因此选择适宜的接种方法显得尤为重要。目前肿瘤组织样本的皮下接种法包括穿刺套针接种和皮肤切开缝合接种。本研究比较了裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果，为提高鼻咽癌临床样本接种和鼠间传代成活率奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验细胞及动物人鼻咽癌HONE-1细胞(广西医科大学耳鼻咽喉头颈外科学实验室提供) ; SPF级雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠9只(3～4周龄，体质量15 g左右)，由广西医科大学实验动物中心提供。1.2人鼻咽癌HONE-1细胞处理人鼻咽癌HONE-1细胞加入含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105U/L的IMDM培养基中，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养，每1～2 d换液1次，5～6 d传代1次。取对数生长期的HONE-1细胞，用无血清IMDM培养液制成细胞悬液，调整最终细胞浓度为6×105/mL，使用1 mL注射器，将HONE-1细胞分别接种于1只原代裸鼠左右两侧腋窝下，接种量为每只0.1 mL，约含6×106个细胞。瘤块约1 cm×1.5 cm左右时，断颈处死裸鼠，取瘤块冰上备用。

1.3皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞8只传代裸鼠随机分为A、B组，各4只。各组在SPF级环境下饲养，保持一定的湿度和温度。所有裸鼠采用1%戊巴比妥钠0.007 mL/g腹腔注射。75%乙醇全身消毒后，医用胶带将裸鼠四肢固定于一次性垫布。取出裸鼠细胞株移植瘤块，放于含青霉素和链霉素各1×105U/L磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，去除包膜。再置于无血清改良型1640培养液中剪切至1 mm×1 mm×1 mm大小，以每只取18块细胞株移植瘤组织块约0.022 g，A、B组分别使用皮肤切开缝合接种和穿刺套针接种方法接种细胞株移植瘤组织块于裸鼠右侧腋下。A组使用眼科剪剪开腋下皮肤约0.7 cm并稍撑开皮肤形成接种间隙，将约18块1 mm直径的瘤块放入皮下间隙，再进行皮肤缝合; B组使用16号骨穿针吸取2～3块已剪碎的肿瘤组织，接种裸鼠腋下，骨穿针刺入裸鼠皮下稍扩大皮下间隙形成“接种袋”，后将针管内瘤块推出至皮下，徒手固定瘤块数秒后再退针，接种约18块瘤块后完成接种。接种过程中记录两组接种时间。

1.4观察方法肿瘤出现时间:接种后每天观察两组移植瘤组织接种部位皮肤改变、硬结出现时间等情况，以肉眼可见肿瘤记录为肿瘤出现时间［2］。裸鼠体质量、肿瘤体积:每天观察两组裸鼠的营养情况、精神状态、皮毛光泽度和肿瘤生长情况，每天定时称取小鼠体质量。待成瘤之后，隔天观察、测量肿瘤的体积(V)，V=π/6a2b，其中a、b分别为肿瘤的长短径［3］。肿瘤质量:于接种组织15 d后，处死裸鼠，观察肿瘤外观质地。取瘤体用分析天平称重。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

A、B组肿瘤出现时间均于接种后第3天。与B组相比，A组裸鼠较早出现精神萎靡、皮肤粗糙、毛发光泽不良、食欲不振、活动量减低、脊椎明显、弓背等。两组荷瘤裸鼠体质量均有所下降，A组比B组肿瘤生长迅速，详见表1。两组裸鼠肿瘤外观无明显差别，均呈多结节融合的椭球形、球形、分叶状，表面光滑、平整，质地实性;两组皮下可见丰富的血管网。A、B组肿瘤质量分别为(0.85±0.39)、(0.75 ±0.30) g，两组比较，P＞0.05。A、B组接种时间分别为(47.0±17.3)、(53.3±20.3) min，两组比较，P ＞0.05。

表1　不同接种时间两组荷瘤裸鼠体质量、肿瘤体积比较(±s)

组别　体质量(g)　肿瘤体积(cm3) A 组1 d　15.80±1.78　－5 d　14.75±0.73　0.066 8±0.036 7 9 d　13.15±1.30　0.423 6±0.230 0 15 d　14.03±1.00　1.407 1±0.573 1 B组1 d　16.20±0.92　－5 d　14.96±0.64　0.082 8±0.002 4 9 d　14.05±1.19　0.364 2±0.245 7 15 d　13.33±1.47　0.934 9±0.553 6

3　讨论

鼻咽癌动物模型主要分为诱发性动物模型、移植性动物模型、转基因和基因敲除动物模型、转移动物模型等4种［4］，其构建方法各有优缺点。移植瘤模型具有可操作性强，成瘤周期短，并且在一定程度上符合人类肿瘤形成的病理过程等特点，是应用最多的肿瘤动物模型构建方法［5］。目前认为，利用免疫缺陷动物体内传代的方法筛选出不同器官亲和性的转移瘤细胞亚株，是研究肿瘤细胞转移机制较重要的手段之一［6］。1969年，Rygaard等［7］首次在裸鼠体内成功移植了人结肠癌组织，开辟了人肿瘤动物移植模型研究的新途径和方法。此后，大量不同类型的人肿瘤组织在免疫缺陷动物体内获得造模成功［8～11］，这为研究肿瘤发病机理、侵袭转移机制、肿瘤药物筛选、免疫治疗等提供了基本工具和模型。有研究［12］用大量的鼻咽癌临床组织成功构建出鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。动物体内肿瘤移植方法主要有组织移植法和细胞悬液注射法等［13］。文庆莲等［14］用CNE-1细胞株比较细胞悬液接种法、新鲜组织块接种法、冻存组织块和细胞匀浆接种法，发现新鲜组织块成瘤率为100%，明显优于其他方法。我们结合前期预实验也发现组织接种法比较实用，操作简单，能很好保持人癌生物学特性而且成功率较高。本课题组前期在利用鼻咽癌临床样本构建广西地区人鼻咽癌裸鼠移植瘤过程中发现，皮肤切开缝合接种成瘤率为78.7% (37/47)，穿刺套针接种成瘤率为52.8%(19/36)。但每次实验中存在临床鼻咽癌活检样本恶性程度不同、肿瘤组织大小不一、裸鼠状态不同等因素，难以准确地比较两种接种方法对构建移植瘤的影响。因此，本研究以BALB/c裸鼠为研究对象，选择穿刺套针接种和皮肤切开缝合接种来建立皮下移植瘤模型。

本实验结果发现，穿刺套针接种和皮肤切开缝合接种均在3 d左右成瘤，成瘤率100%。皮肤切开缝合接种和穿刺套针接种的裸鼠瘤块均生长迅速，且前者肿瘤组织较后者生长迅速，可能由于皮肤切开缝合接种对肿瘤组织样本的挤压较少，更好地保留了原样本的生物活性，提高了肿瘤组织对移植区微环境的适应能力。但由于例数限制，两组比较差异无统计学意义。皮肤切开缝合接种比穿刺套针接种时间短、利于操作，但由于皮肤切开及后续缝合操作对裸鼠机体损伤略大，体质量下降较明显，不利于体弱裸鼠的存活，但经过10 d左右可逐渐恢复。本研究结果可见，两组接种后体质量均下降，皮肤切开缝合接种组更明显，但后期略有上升，可能为接种操作对裸鼠造成了创伤，影响了裸鼠进食和活动，因此保证裸鼠的营养和生长亦是成瘤的关键。

综上所述，裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞均能达到好的成瘤效果。

参考文献:

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Comparison of tumorigenic effect between inoculating method of slicing subaxillary skin and suturing and method of adopting paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on nude mice

WU Yuan1，ZHOU Xun-zhao，ZHONG Chang-tao，YAN Kui，WEI Zheng-bo，XIE Ying
(1 Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the tumorigenic effect between the inoculating method of slicing the subaxillary skin and suturing and the method of adopting the paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on the nude mice.Methods The samples of subcutaneous transplanted tumors in nude mice were established with nasopharyngeal carcinoma HONE-1 cells.Eight BALB/c nude mice were randomly divided into two groups: group A and B，4 mice in each group.The right subaxillary skin of each mouse was subcutaneously inoculated with the tissue masses through slicing the skin，or adopting the paracentesis trocar in the two groups，respectively.The occurrence time，volume and mass of tumor in each group were compared.Results The occurrence time of tumor in each group was 3 days after being inoculated.Compared with group B，the occurrence time of dispirited mind，coarse skin，shineless hair，loss of appetite，low activity，distinct spinal column，hunched backs and other conditions were earlier in the group A.The weight of mice was decreased in both groups，the growth of tumor in the group A was faster than that of the group B，but no significant difference was found between these two groups.The mass of tumor in the group A and group B was (0.85±0.39) g and (0.75±0.30) g，respectively; and no significant difference was found between these two groups (P＞0.05).ConclusionBoth the inoculating method of slicing the subaxillary skin and suturing and the method of adopting the paracentesis trocar of human nasopharyngeal carcinoma on the nude mice could receive finely tumorigenic effect.

Key words:nasopharyngeal neoplasms; animal experimental model; tumorigenicity; inoculating method of slicing and suturing the skin; inoculating method of adopting the paracente sis trocar

(收稿日期:2015-02-04)

通信作者简介:谢莹(1978-)，女，博士，副教授，研究方向为鼻咽癌综合防治研究。E-mail: xieying2002@ hotmail.com

作者简介:第一吴媛(1989-)，女，硕士研究生在读，研究方向为鼻咽癌综合防治研究。E-mail: 540282860@ qq.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81160329) ;广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室研究项目(GK2013-B-02) ;广西自然科学基金资助项目(2014GXNSFAA118187)。

文章编号:1002-266X(2015) 19-0005-03

文献标志码:A

中图分类号:R739.6

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.002