人小细胞肺癌NCI-H446细胞成瘤组织中HSG及WNT/Ca2+信号通路相关基因表达△

吴闽付，陶金艳，葛正行

贵阳中医学院研究生院，贵阳550021

小细胞肺癌占肺癌的15%～20%，其恶性程度极高，5年生存率仅为10%～20%[1]。小细胞肺癌对化疗比较敏感，初治缓解率较高，但极易发生耐药，由于小细胞肺癌细胞具有生长分数高、倍增时间短的特点，因此多数患者在确诊时往往已发生远处转移。目前，临床针对小细胞肺癌的治疗仍不具有靶向性。但已有研究发现，细胞增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene，HSG）基因 、WNT/Ca2+信号通路与肿瘤的生长和转移密切相关[2]，但目前针对其与小细胞肺癌关系的研究仍较少。本研究对小细胞肺癌中HSG基因及WNT/Ca2+信号通路关键基因的表达情况进行分析，旨在为临床小细胞肺癌的基因靶向治疗提供理论参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

裸鼠20只，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，雌雄各10只，年龄为6～8周，体重为18～22 g，购自常州卡文实验动物有限公司，合格证书[SCXK（苏）2011-0003]。

1.2 试剂与仪器

Trizol总RNA提取试剂购自GenStar-Biosolutions公司，反转录试剂盒及扩增试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，人小细胞肺癌NCIH446细胞购自齐氏生物科技有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计购自美国Thermo公司，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）仪和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国ABI公司，凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.3 细胞培养

将NCI-H446细胞静置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，随后进行传代，分别在含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中培养，取第2代NCI-H446细胞用于接种。

1.4 裸鼠成瘤

1.4.1 细胞接种将第2代NCI-H446细胞制成浓度为1×107/HP的细胞悬液，在100级实验室内，用带6号针头的2.5 ml注射器取1 ml细胞悬液注射于裸鼠皮下，双前肢腋下注射约0.2 ml[3-4]。

1.4.2 裸鼠肿瘤组织提取与鉴定接种后5天左右，接种部位表面可见一暗红色突起肿瘤组织，拖颈处死裸鼠，切开肿块皮肤取出肿块，将肿瘤组织切成重量为50～100 mg的组织块，随机取肿瘤组织块于10%中性福尔马林固定液中固定，将标本送于贵阳中医学院第二附属医院病理科进行病理鉴定。

1.5 HSG、WNT 5 A及WNT11基因表达水平的检测

取50 mg肿瘤组织及50 mg距肿瘤组织1 cm的皮肤组织（癌旁组织），采用液相提取法提取肿瘤组织和癌旁组织总RNA，随后对总RNA进行琼脂糖电泳检测其质量。将提取的总RNA逆转录成cDNA，逆转录体系：4 μl 5×Prime Script Buffe（rfor real time），1 μl Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μl Oligo dT Primer（50 μmol/L），1 μl Random 6 mers（100 μmol/L），2 μl cDNA 模 板 ，9 μl Rnase Free ddH2O；反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反应产物于4℃冰箱保存。按如下方法构建PCR反应体系：SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10 μl，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，PCR Reverse Prime（r10 μmol/L）0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA模板2 μl，Rnase Free ddH2O 6 μl。按两步法设置反应条件：第一步，90℃30 s预变性，共1个循环；第二步，95℃5 s，60℃34 s，共40个循环。采用7500 Software v2.3软件分析PCR结果。基因的相对表达量用ΔΔCt法表示，具体计算公式：成瘤组基因ΔCt=成瘤组基因Ct值-内参基因Ct值；对照组基因ΔCt=对照组基因Ct值-内参基因Ct值；ΔΔCt值=成瘤组基因ΔCt-对照组基因ΔCt；倍数变化采用 2-ΔΔCt表示，2-ΔΔCt＞1表示成瘤组基因表达水平高于对照组，2-ΔΔCt＜1表示对照组基因表达水平高于成瘤组，2-ΔΔCt=1表示两组表达水平一致。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成瘤组织鉴定结果

20只接种NCI-H446细胞悬液的裸鼠中，1只裸鼠于操作过程中死亡，15只裸鼠成功成瘤，成瘤率为78.9%（15/19）。肿瘤组织在苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色下可见小于静止期小淋巴细胞大小的肿瘤细胞，其形态具有圆形、卵圆形或梭形核，细胞质稀少，细胞核内染色质呈细颗粒状，核仁缺乏或不明显，细胞边界不清，可见核切迹，核分裂数高（图1）。成瘤组织病理学形态与NCI-H446细胞肿瘤病理学形态大致相同，说明造模成功。

图1 裸鼠成瘤组织的病理切片（HE染色，×200）

2.2 基因扩展效率分析

取同一标准HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的cDNA模板，进行1倍、10倍、100倍浓度稀释，分别在同一扩展体系下进行基因扩展，结果显示：HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的扩展效率均为89.25%，r2=0.993；各指标均无引物二聚体以及非特异性扩增高峰的出现，引物设计合理，特异性较高。

2.3 HSG、WNT 5 A及WNT11基因的表达水平

以癌旁组织为对照，成瘤组织中HSG基因的相对表达量明显降低，为（0.79±0.23），WNT5A、WNT11基因的相对表达量明显增高，分别为（6.62±1.45）、（4.80±1.74），差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

HSG基因由中国学者陈光慧发现，其编码产物HSG/MFN2可以通过抑制ERK/MAPK信号转导通路使细胞周期停滞在G0/G1期。HSG基因定位于人1号染色体短臂36.22，该区域易发生基因突变，出现异位或缺失[5]。相关研究表明，HSG基因通过影响线粒体融合度及活动性而参与细胞分化过程[6]。进年来，HSG基因作为一个抑癌基因逐渐被人们重视[7]。也有研究证明，HSG基因具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用[8]。HSG基因与肿瘤转移有关[9-11]。本研究结果显示，成瘤组织中HSG基因的相对表达量明显低于癌旁组织（P＜0.01），表明HSG具有抗肿瘤效应，可能为潜在的抑癌基因[12-13]，为小细胞肺癌的早期治疗提供靶点。

WNT/Ca2+信号通路属于WNT信号通路中的非经典通路之一，激活该通路的关键蛋白有WNT5A、WNT11，该通路被激活后可引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca2+敏感信号成分的激活，以调节细胞黏着和细胞运动。WNT5A在各器官肿瘤发展过程中起到重要的作用，在各系统肿瘤组织中都有较高表达[14-15]。相关研究表明，WNT信号异常激活与拮抗基因SFRP的缺失或启动子的甲基化导致基因沉默或表达下调有关[16]。本研究结果显示，WNT5A、WNT11在成瘤组织中的表达水平明显增高，表明WNT/Ca2+信号通路在成瘤组织中大量开放，并参与成瘤的过程。

综上所述，HSG基因表达水平降低及WNT/Ca2+信号通路大量开放共同作用，可以促进小细胞肺癌细胞的生长及转移。但本研究因受实验经费影响，实验样本较小，未进行相关蛋白检测，因此本实验结果仅为后续相关实验提供有限参考。