mM-CSF及其剪切体对淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖的抑制作用

马翠花，种靖慧，廖金凤，林永敏，卫佳，郑国光(中国医学科学院血液学研究所血液病医院，天津300020;2秦皇岛市第一医院)

mM-CSF及其剪切体对淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖的抑制作用

马翠花1，2，种靖慧1，廖金凤1，林永敏1，卫佳1，郑国光1
(1中国医学科学院血液学研究所血液病医院，天津300020;2秦皇岛市第一医院)

摘要:目的探讨膜结合型巨噬细胞集落刺激因子(mM-CSF)及其剪切体(mM-CSF-Δ)对淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖的抑制作用。方法采用Overlap PCR法构建带有mM-CSF的真核表达质粒pTARGET-mM-CSF，再进一步构建胞内区截短30个氨基酸的表达质粒pTARGET-mM-CSF-Δ，并进行PCR及DNA双向测序鉴定。将空载体pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mM-CSF-Δ质粒分别转染Ramos细胞，经G418筛选稳定表达细胞株，并用RT-PCR、Western blotting进行鉴定; MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建了mM-CSF和mM-CSF-Δ的真核表达载体，获得了稳定转染细胞株Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞增殖能力的OD值分别为0.413±0.014、0.384±0.019、0.463±0.037，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较，Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与Ramos-V细胞比较，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞处于G0/G1期的比例分别为41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较，Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与Ramos-V细胞比较，P＜0.05或＜0.01。结论mM-CSF、mM-CSF-Δ均能抑制淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖，且后者抑制作用更强。

关键词:白血病; Ramos细胞;巨噬细胞集落刺激因子;膜结合型巨噬细胞集落刺激因子;剪切体;细胞增殖;细胞周期

细胞因子是传递细胞间通信的重要载体之一，其表达、定位发生改变会引起细胞间信号的异常传递。除了经典的可溶性形式，许多细胞因子如TGF-α、干细胞因子等，还以膜结合形式存在，并与其受体通过并置性作用机制参与邻近细胞之间的细胞通信［1］。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)经选择性剪接可产生3种异构体，即膜结合型CSF (mM-CSF)、分泌型CSF(sM-CSF)和基质型CSF (PG-M-CSF)［2］。mM-CSF作为膜结合型细胞因子，其异常表达与血液肿瘤细胞的关系备受关注。本研究旨在探讨mM-CSF对淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖的影响及其机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂RPMI1640培养基购自Gibco公司，TRIzol、MML-V试剂和LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、PyrobestTMDNA聚合酶、质粒提取和胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司，PCR扩增引物的合成与DNA测序均由上海生工公司完成，Anti-MCSF抗体购自R＆D公司，Super-Signal West Pico化学发光试剂盒购自美国Pierce公司，G418和MTT购自Sigma公司。

1.2pTARGET-mM-CSF和pTARGET-mM-CSF-Δ真核表达载体的构建用Overlap PCR方法获得mM-CSF序列。以含有M-CSF基因的pCDNA3.0质粒(购自Santa公司)为模板，分别扩增、纯化出mMCSF的两段编码序列mM-CSF1(Forward为5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse为5'-CTCATGGCCTTGGCTGGA-3';片段大小543 bp)和mM-CSF2(Forward为5'-TCCAGCCAAGGCCATGAG-3'，Reverse为5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小228 bp)，然后以它们的混合物为模板用mM-CSF的克隆引物(Forward为5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse为5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小771 bp)扩增出完整的mM-CSF序列。再以mM-CSF序列为模板，应用mM-CSF-Δ的克隆引物(Forward为5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse为5'-ACGGGGTACCCTAGCTCCTCCGCCTCCACC-3';片段大小681 bp)扩增胞内区编码30个氨基酸的基因片段获得mM-CSF-Δ序列。以上PCR反应步骤均如下:用高保真PyrobestTMDNA聚合酶进行PCR;94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃7 min结束反应。分别胶回收带有mM-CSF和mM-CSF-Δ序列的PCR产物，经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切并与pTARGET载体连接，转化感受态E.coli DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，进行PCR鉴定及DNA双向测序鉴定。PCR鉴定插入片段大小正确(图1)，DNA测序正确。

1.3细胞转染、筛选及鉴定Ramos细胞(由本室保存)用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。选取对数生长期细胞进行实验。24孔板每孔接种5×105个Ramos细胞，悬于500 μL无抗生素、含10% FBS的1640培养液，按照LipofectamineTM2000说明书进行操作，将空载体pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mMCSF-Δ质粒分别转染Ramos细胞，分别命名为Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ细胞。转染后48 h，加入1 400 μg/mL G418进行筛选，每2 d换液1次，筛选后的第14天将细胞转移至25 mL的培养瓶。稳定转染的细胞株采用RT-PCR和Western blotting进行鉴定。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ细胞，用RT-PCR检测mM-CSF、mM-CSF-Δ(mM-CSF鉴定引物Forward为5'-GCGCTTCAGAGATAACACC-3'，Reverse为5'-CCTCCGCCTCCACCTGTAGA-3';片段大小382 bp)和质粒自身的Neo基因(Forward为5'-GGTGGAGAGGCTATTCGGCT-3'，Reverse为5'-GATAGAAGGCGATGCGCTGC-3';片段大小728 bp)。按产品说明书，用TRIzol提取细胞总RNA，并用MML-V反转录酶将1 μg总RNA反转录为cDNA，以甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参(Forward为5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，Reverse为5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';片段大小226 bp)，取2 μL进行PCR，进行25个循环，具体反应条件同1.2，产物经琼脂糖凝胶电泳。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ细胞各5×106个，分别加入裂解液提取总蛋白。样品经10% SDS-PAGE分离后，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶4℃封闭过夜，1∶200稀释M-CSF抗体室温孵育2 h，洗膜后1∶2 000稀释二抗室温孵育1 h，最后暗室中以化学发光法显色，X线片曝光。RT-PCR在上述细胞株均能检测出质粒所带Neo基因; mM-CSF和mM-CSF-Δ分别表达于Ramos-M和Ramos-Δ细胞中(图2)。Western blotting从蛋白水平检测发现mM-CSF和mM-CSF-Δ在稳定转染细胞中表达(图3)。

1.4细胞增殖检测采用MTT法。收集并计数细胞，分别用含10% FBS的RPMI1640培养液将细胞调整为1×105/mL，以每孔180 μL接种于96孔培养板，培养44 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)继续培养4 h，离心后除去上清加入150 μL DMSO振荡10 min后使用酶标仪检测每孔于546 nm波长处的光密度(OD)值，实验结果取5孔的均值。

1.5细胞周期检测收集并计数已培养48 h的Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ细胞各1×106cells，PBS洗1次，70%乙醇4℃固定24 h，离心弃上清，加RNaseA 5 μL(10 μg/μL)，室温孵育15 min后加200 μL PI，避光室温孵育30 min，流式细胞术检测细胞周期。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞增殖能力的OD值分别为0.413±0.014、0.384±0.019、0.463 ±0.037，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较，Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与Ramos-V细胞比较，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V细胞处于G0/G1期的比例分别为41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M细胞与Ramos-Δ细胞比较，Ramos-M、Ramos-Δ细胞分别与Ramos-V细胞比较，P＜0.05或＜0.01。

3　讨论

M-CSF又称集落刺激因子1(CSF-1)，经选择性剪接形成的3种异构体均是c-fms原癌基因编码跨膜糖蛋白M-CSF受体的配体［3］。其中，sM-CSF前体含外显子编码的蛋白酶切位点，可以被蛋白酶切释放sM-CSF;但人mM-CSF前体分子缺乏相应的蛋白酶切位点而形成膜结合的形式［2］。M-CSF被认为是一个多功能的细胞因子，不仅在造血系统中担负着调节单核/巨噬细胞增殖、分化等功能，而且还在妇科肿瘤、骨代谢、炎症反应、甲状腺癌、前列腺癌及一些中枢系统疾病中发挥重要作用［4～6］。

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，在不同的微环境被多种细胞因子或趋化因子活化形成不同的表型［7，8］，在肿瘤发展过程中充当一把“双刃剑”。直肠癌微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过分泌TNF-α、IL-6来增强肿瘤细胞的浸润、转移能力，促进肿瘤的进展［9］。研究［10］报道，TAM的分化也能被INF-γ抑制，降低胆囊癌中VEGF的浓度，减少胆囊癌血管产生，从而抑制胆囊癌的进展。mM-CSF作为细胞因子中的一员，对巨噬细胞功能极化的影响是肿瘤发展进程的关键。在肝癌、神经胶质瘤及乳腺癌中均发现，表达mM-CSF的肿瘤细胞能够引起巨噬细胞的抗肿瘤免疫效应［11～13］;而mM-CSF与其受体介导的并置性刺激作用却可促进血液恶性细胞增殖［1］，而且它可以通过异常活化巨噬细胞对血液系统恶性肿瘤的发展起促进作用［14］。mM-CSF在不同微环境中发挥不同作用，其机制越来越受到关注。

本文在不表达M-CSF受体的Ramos细胞中分别构建了稳定表达mM-CSF及胞内区截短30个氨基酸的mM-CSF(mM-CSF-Δ)细胞株，mM-CSF、mMCSF-Δ均能抑制淋巴细胞白血病Ramos细胞增殖，且后者抑制作用更强。可见，mM-CSF胞外区抑制Ramos细胞增殖作用更明显，这为进一步深入研究mM-CSF在恶性肿瘤中的作用机制奠定了基础。

参考文献:

［1］王大刚，郑国光，种靖慧，等.膜结合型干细胞因子促进白血病细胞K562的增殖和集落形成［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(1) : 6-11.

［2］Cerretti DP，Wignall J，Anderson D.Human macrophage-colony stimulating factor: alternative RNA and protein processing from a single gene［J］.Mol Immunol，1988，25(8) : 761-770.

［3］Sherr CJ，Rettenmier CW，Sacca R，et al.The c-fms proto-oncogene product is related to the receptor for the mononuclear phagocyte growth factor，CSF-1［J］.Cell，1985，41(3) : 665-676.

［4］Aharinejad S，Salama M，Paulus P，et al.Elevated CSF1 serum concentration predicts poor overall survival in women with early breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2013，20(6) : 777-783.

［5］Ryder M，Gild M，Hohl TM，et al.Genetic and pharmacological targeting of CSF-1/CSF-1R inhibits tumor-associated macrophages and impairs BRAF-induced thyroid cancer progression［J］.PLoS One，2013，8(1) : e54302.

［6］Xu J，Escamilla J，Mok S，et al.CSF1R signaling blockade stanches tumor-infiltrating myeloid cells and improves the efficacy of radiotherapy in prostate cancer［J］.Cancer Res，2013，73 (9) : 2782-2794.

［7］Ruffell B，Affara NI，Coussens LM.Differential macrophage programming in the tumor microenvironment［J］.Trends Immunol， 2012，33(3) : 119-126.

［8］De Palma M，Lewis CE.Macrophage regulation of tumor responses to anticancer therapies［J］.Cancer Cell，2013，23(3) : 277-286.

［9］张银旭，张俊华，刘宇，等.直肠癌中肿瘤相关巨噬细胞、炎性因子的表达变化及意义［J］.山东医药，2011，51(18) : 97-98.

［10］孙涛，张明宇，程颖，等.通过INF-γ影响肿瘤相关巨噬细胞抑制胆囊癌血管发生的实验研究［J］.山东医药，2011，51(48) :25-27.

［11］Dan Q，Sanchez R，Delgado C，et al.Non-immunogenic murine hepatocellular carcinoma Hepa1-6 cells expressing the membrane form of macrophage colony stimulating factor are rejectedin vivo and lead to T-cell immunity against the parental tumor［J］.Mol Ther，2001，4(5) : 427-437.

［12］Jadus MR，Chen Y，Boldaji MT，et al.Human U251MG glioma cells expressing the membrane form of macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) are killed by human monocytes in vitro and are rejected within immunodeficient mice via paraptosis that is associated with increased expression of three different heat shock proteins［J］.Cancer Gene Therapy，2003，10(5) : 411-420.

［13］Williams CC，Trinh H，Tran TV，et al.Membrane macrophage colony-stimulating factor on MADB106 breast cancer cells does not activate cytotoxic macrophages but immunizes rats against breast cancer［J］.Mol Ther，2001，3(2) : 216-224.

［14］Wang L，Zheng GG，Ma CH，et al.A special linker between macrophage and hematopoietic malignant cells: membrane form of macrophage colony-stimulating factor［J］.Cancer Res，2008，68(14) : 5639-5647.

Inhibitory effect of mM-CSF and its spliceosome on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos

MA Cui-hua1，CHONG Jing-hui，LIAO Jin-feng，LIN Yong-min，WEI Jia，ZHENG Guo-guang
(1 Institute of Hematology＆Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of membrane-bound macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) and its spliceosome (mM-CSF-Δ) on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos.Methods The eukaryotic expression plasmid of pTARGET-mM-CSF with mM-CSF was constructed with Overlap PCR，and then pTARGET-mM-CSF-Δ of 30 amino acide located in the intracellular region of brachytmema mutation was obtained; and meanwhile，they were identified by PCR and DNA sequencing.The empty vector pTARGET，pTARGET-mM-CSF and pTARGET-mM-CSF-Δ plasmid were transfected into Ramos cells，the cell line with stable expression was screened by G418 and was detected by RT-PCR and Western blotting.Proliferation and cell cycle of these stably transfected cells were detected by MTT and flow cytometry.Results The mM-CSF and mM-CSF-Δ eukaryotic expression vectors were successfully constructed.The stable transfectants Ramos-V，Ramos-M and Ramos-Δ were obtained.The OD of proliferation ability of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V were 0.413±0.014，0.384±0.019 and 0.463±0.037，respectively.Significant difference was found between the cell lines of Ramos-M and Ramos-Δ，among the cell lines of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V，respectively (P＜0.05 or P＜0.01).The proportion of G0/G1phases of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells were 41.54%±1.22%，45.60%±1.09% and 39.20%±1.53%，respectively.Significant difference was found betweenbook=2,ebook=121Ramos-M and Ramos-Δ cells，among Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion mM-CSF and mM-CSF-Δ may inhibit the proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos and the inhibitory effect of the latter is stronger.

Key words:leukemia; Ramos cells; macrophage colony-stimulating factor; membrane-bound macrophage colonystimulating factor; spliceosome; cell proliferation; cell cycle

(收稿日期:2015-03-25)

通信作者简介:郑国光(1967-)，男，博士，研究员，研究方向为血液细胞生物学、分子生物学。E-mail: zhengggtjchn@ aliyun.com

作者简介:第一马翠花(1981-)，女，博士，助理研究员，研究方向为分子生物学。E-mail: michellemch@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81170511，81370634) ;教育部新世纪优秀人才计划(NCET-08-0329)。

文章编号:1002-266X(2015)19-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.001