橙皮苷联合氟化钠对体外牛牙釉质矿化的影响

杨文华，孙路全，刘东妮，马金双，张向宇(天津市北辰医院，天津300400;天津医科大学附属口腔医院)

橙皮苷联合氟化钠对体外牛牙釉质矿化的影响

杨文华1，孙路全1，刘东妮1，马金双1，张向宇2
(1天津市北辰医院，天津300400;2天津医科大学附属口腔医院)

摘要:目的对牛牙进行体外抑制脱矿和再矿化实验，探讨橙皮苷联合氟化钠对牙釉质矿化的影响。方法用48颗新鲜牛牙制备牙釉质切片，随机分为四组，分别采用氟化钠(阳性对照组)、去离子水(阴性对照组)、橙皮苷(实验1组)、橙皮苷联合氟化钠(实验2组)进行体外抑制脱矿和再矿化实验。测定各组药物处理釉质切片后钙离子和磷离子的流出量、再矿化实验中釉质表面显微硬度，利用X线能谱仪分析釉质标本表面钙、磷原子含量并计算钙原子/磷原子。结果实验1组钙离子和磷离子的流出量、釉质表面显微硬度与阳性对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，与阴性对照组比较差异无统计学意义;实验2组钙离子和磷离子的流出量、釉质表面显微硬度与阳性对照组比较差异无统计学意义，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。结论在体外条件下，氟化钠可抑制牛牙釉质脱矿促进再矿化，橙皮苷对牛牙釉质无明显直接抑制脱矿和促进再矿化作用，与氟化钠联用无明显协同作用，但橙皮苷可能具有稳定牙釉质晶体结构的作用，有助于牙釉质再矿化。

关键词:橙皮苷;氟化钠;再矿化;抑制脱矿;牛牙

橙皮苷是从柠檬中提取的一种黄酮类物质，具有较强的抗炎活性［1］，能抑制细菌、真菌、病毒生长和繁殖［2］。研究发现，橙皮苷具有抗牙龈卟啉单胞菌的作用［3］，对变异链球菌乳酸脱氢酶及蔗糖酶有很好的抑制作用，可减少细菌产酸，预防龋齿［4，5］。氟化钠具有抑制釉质脱矿和促进再矿化的作用［6］。2014年，我们对牛牙进行体外抑制脱矿和再矿化实验，检测橙皮苷对牙釉质矿化的影响及其与氟化钠联合应用的效果，为天然抗龋药物的研发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料选择同一种类2～3岁牛的新鲜下颌，体视显微镜下观察，取无龋损、氟斑、裂痕牙48颗，去污，分离冠根，用高速切割机沿正中矢状长轴将每个切牙冠切成6 mm×6 mm×2 mm的釉质切片，丙烯酸树脂包埋后暴露唇面釉质，留出5 mm×5 mm釉质面，抛光，超声清洗，自然干燥。

1.2牙釉质钙、磷离子浓度检测

1.2.1抑制脱矿实验取24颗牛牙的釉质切片，随机分为阴性对照组(加入去离子水)、阳性对照组(加入氟化钠1 mg/mL)［10］、实验1组(加入橙皮苷5 mg/mL)、实验2组(加入橙皮苷5 mg/mL+氟化钠1 mg/mL)［11］各6片，分别加入相应药物30 mL后，以100 r/min匀速搅拌15 min，弃处理液，用去离子水冲洗，加入脱矿液(50 mmol/L乙酸、1.5 mmol/L氯化钙、0.9 mmol/L磷酸二氢钾，用氢氧化钾将pH调至5.0) 30 mL，37℃水浴100 r/min匀速搅拌30 min，取酸蚀后的脱矿液，用全自动生化分析仪测定钙、磷离子浓度。

1.2.2再矿化实验取24颗牛牙的釉质切片，浸入30 mL脱矿液中，37℃处理96 h。将脱矿后的切片按照1.2中的分组方法随机分为四组，再次浸入脱矿液中反应14 h，分别加入对应药物反应2 h，再矿化液［1.5 mmol/L氯化钙、0.9 mmol/L磷酸二氢钾、130 mmol/L氯化钾、20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，用氢氧化钾调pH至7.0］反应8 h。每两个步骤之间使用缓冲液(130 mmol/L氯化钾、20 mmol/L HEPES，用氢氧化钾调pH至7.0)冲洗5 min，连续循环8 d。收集循环中的脱矿液，用全自动生化分析仪测定钙、磷离子浓度。

1.3观察指标的测算①钙、磷离子流出量(ESR) : ESR=(未使用实验药物处理釉质切片前各组脱矿液中离子浓度－实验药物处理釉质切片后各组脱矿液中离子浓度)/未使用实验药物处理釉质切片前各组脱矿液中离子浓度。②釉质表面显微硬度(SMH)及SMH恢复率(EMHR) :脱矿处理前、脱矿后及再矿化实验后，将标本置于显微硬度计(努氏压头，9.8 N，20 s)下，在每个标本釉质表面中央垂直测5个点，读取SMH值，根据SMH计算EMHR，EMHR=(再矿化实验后的SMH－脱矿后的SMH)/(脱矿前的SMH－脱矿后的SMH)。③钙磷原子比值:使用X射线能谱仪，采用质谱分析法检测再矿化实验后各组牙釉质表面钙、磷原子含量，并计算钙原子/磷原子。

1.4统计学方法采用SPSS19.0统计软件，计量资料采用珋x±s表示，对符合正态分布的计量资料和不符合正态分布的计量资料通过Box-cox转换后进行单因素方差分析，LSD法进行两两比较。α=0.05。

2　结果

2.1抑制脱矿后及再矿化后各组钙、磷ESR抑制脱矿后及再矿化后，实验1组钙、磷ESR显著高于阳性对照组(P＜0.05)，与阴性对照组比较差异无统计学意义;实验2组钙、磷ESR显著低于阴性对照组(P＜0.05)，与阳性对照组比较差异无统计学意义。见表1。

表1　抑制脱矿实验及再矿化实验后各组钙、磷ESR比较(n=6，mmol/L，±s)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与阳性对照组比较，#P＜0.05。

组别　钙ESR抑制脱矿后　再矿化后磷ESR抑制脱矿后　再矿化后阴性对照组4.54±0.40　0.90±0.15　2.39±0.27　1.32±0.05阳性对照组　2.32±0.21*0.48±0.04*　1.31±0.09*0.54±0.03*实验1组　4.67±0.33#0.81±0.08#　2.38±0.18#1.23±0.17#实验2组　2.18±0.22*0.47±0.07*　1.24±0.09*0.47±0.05*

2.2再矿化后各组釉质SMH及EMHR实验1 组EMHR显著低于阳性对照组(P＜0.05)，实验2组EMHR显著高于阴性对照组(P＜0.05)。见表2。

表2　再矿化后各组釉质SMH及EMHR比较(n=6，±s)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与阳性对照组比较，#P＜0.05。

组别SMH(kg/mm2)脱矿前　脱矿后　再矿化后EMHR(%)阴性对照组　410.96±7.18　317.26±6.16　320.73±7.33#3.91±10.66阳性对照组　413.80±8.06　321.10±5.89　369.07±9.48*51.48±10.76*实验1组　409.71±7.91　320.63±6.32　335.45±9.03#15.90±12.11实验2组　409.94±7.82　319.00±5.76　377.01±8.88*63.82±11.74*

2.3再矿化后各组釉质表面钙、磷原子及钙原子/磷原子实验1、2组与阴性对照组比较均有统计学差异(P均＜0.05)，与阳性对照组比较无统计学差异。见表3。

表3　再矿化实验各组釉质表面钙、磷原子含量及钙原子/磷原子(n=6，±s)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与阳性对照组比较，#P＜0.05。

组别　钙原子(%)　磷原子(%)　钙原子/磷原子阴性对照组　16.50±3.98#12.51±1.74#　1.30±0.14#阳性对照组　23.24±2.45*14.04±0.91*　1.65±0.09*实验1组　18.48±1.76*12.48±1.54*　1.49±0.17*实验2组　18.09±1.23*11.57±0.63*　1.57±0.19*

3　讨论

龋病是在致龋菌感染的基础上，发生牙体硬组织的无机成分脱矿、有机成分溶解等一系列组织学改变的慢性感染性疾病［7］。研究发现，患龋牙齿在唾液中维持着脱矿—再矿化的生物循环过程，对龋病治疗应着重于抑制牙体表面脱矿和降低致龋菌酶活性方面。再矿化是在已经脱矿的牙齿硬组织内发生矿物质的重新沉积并进行结晶化。研究证实，早期龋损中，氟可以吸附或结合于脱矿釉质表面，促进钙、磷的吸收沉积，促使晶体生长［8］。近年来，天然产物因其来源丰富、取材方便、疗效显著、不良反应小等优点成为防龋研究的热点。橙皮苷是柠檬提取物的主要成分之一，是一种药理活性确切、应用广泛的黄酮类化合物，具有抑菌、抗炎、抗氧化［9］等药理活性。研究证实，柠檬提取物能抑制常见口腔致龋菌的生长［10］，抑制变形链球菌在硬组织表面生长黏附［11，12］，对变形链球菌和绒毛链球菌的葡糖基转移酶和乳酸脱氢酶有抑制作用［13，14］。

本研究显示，抑制脱矿实验中，橙皮苷无明显抑制釉质溶解度的作用，其与氟化钠联合应用与单独使用氟化钠对釉质溶解度的抑制作用无明显差异，提示橙皮苷没有抑制釉质溶解的作用;再矿化实验中，实验1组与阴性对照组对釉质表面显微硬度的作用无明显差异，与阳性对照组、实验2组有显著差异，说明橙皮苷无明显促进脱矿釉质再矿化的作用，与氟化钠联合应用不增强且不影响氟化钠促进釉质再矿化的作用。Islam等［3］报道，橙皮苷可以抑制胶原酶活性，保存牛牙牙本质胶原，可能促进再矿化过程。本研究结果与其不同，可能与我们采用的牛切牙釉质中无机物和有机物成分含量以及橙皮苷浓度不同有关。X线能谱分析各组药物处理后牙釉质表面钙原子/磷原子结果显示，实验1组、实验2组与阴性对照组比较差异有统计学意义，与阳性对照组比较差异有统计学无意义，实验1组钙原子/磷原子增高，提示橙皮苷可能具有稳定牙釉质表面晶体结构作用，有助有牙釉质再矿化，其具体作用机制需进一步研究。

本研究采用质谱分析法分析再矿化实验后的各组样本表面成分及含量。质谱分析操作简便、灵敏度高、样品用量少、分析速度快，可以快速准确地反映各组标本中磷离子含量。实验结果表明，橙皮苷与氟化钠联合使用没有明显增强氟化钠促进牛牙釉质再矿化的作用，对抑制釉质脱矿和再矿化也无明显抑制作用，但橙皮苷可能具有稳定牙釉质表面晶体结构的作用。下一步我们将对橙皮苷治疗龋病的浓度进行观察。

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·临床研究·

(收稿日期:2014-10-25)

文章编号:1002-266X(2015) 18-0038-03

文献标志码:A

中图分类号:R780.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.013