糖尿病肾脏疾病患者外周血单核细胞TLR4基因表达及其与炎性因子的关系

周蒨，董萍，李晗，毛维维，韩冬梅，巩伟伟，冯波(1同济大学医学院，上海0009;上海市第一康复医院;同济大学附属东方医院)

糖尿病肾脏疾病患者外周血单核细胞TLR4基因表达及其与炎性因子的关系

周蒨1，2，董萍2，李晗2，毛维维2，韩冬梅2，巩伟伟2，冯波3
(1同济大学医学院，上海200092;2上海市第一康复医院;3同济大学附属东方医院)

摘要:目的观察糖尿病肾脏疾病(DKD)患者外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)基因表达变化，分析其与相关炎性因子的关系。方法选择2型糖尿病(T2DM)患者149例(T2DM组)，其中单纯糖尿病(SDM) 46例、早期DKD(EDN) 58例、临床DKD(CDN) 45例;另选35例体检健康者作为对照组。RT-PCR法检测外周血单核细胞TLR4 mRNA，常规检测血清白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)。结果与对照组比较，T2DM组外周血单核细胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α均升高(P均＜0.05) ;与SDM比较，EDN、CDN患者TLR4 mRNA及血清CRP均升高(P均＜0.05) ;与EDN比较，CDN患者TLR4 mRNA及血清TNF-α、IL-8、CRP升高(P均＜0.05)。外周血单核细胞TLR4 mRNA的表达与血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相关(r分别为0.653、0.648、0.697，P均＜0.05)。结论DKD患者外周血单核细胞TLR4 mRNA表达增加，且与炎性因子密切相关，共同参与DKD的发生、发展。

关键词:糖尿病并发症;慢性肾脏疾病; Toll样受体4;白细胞介素;肿瘤坏死因子; C反应蛋白

目前，糖尿病肾脏疾病(DKD)是终末肾脏疾病的首位病因［1］。DKD的发病机制至今尚未完全阐明，现已证实与白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)等炎性因子有关［2，3］。Toll样受体4(TLR4)作为介导炎症反应的主要受体，可促进细胞因子的合成和释放，启动炎症反应［4］。2010年1月～2014年6月，我们观察了DKD患者外周血单核细胞TLR4 mRNA的表达情况，并分析其与相关炎性因子的关系。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料选择在上海第一康复医院内分泌科住院的T2DM患者149例(T2DM组)，均符合1999年WHO制定的糖尿病诊断标准［5］，排除合并原发性肾小球疾病、心脑血管、肝脏疾病或其他原因所致肾脏疾病。其中，男81例、女68例;年龄46～74(52.8±7.6)岁，病程2～16(9.2±3.1) a。根据24 h尿蛋白排泄率(UAER)行Mogensen分期［6］，单纯糖尿病(SDM) 46例，早期DKD(EDN) 58例，临床DKD(CDN) 45例。另选体检健康者35例作为对照组，男19例、女16例;年龄40～75(53.6± 4.7)岁。两组性别、年龄具有可比性。

1.2方法

1.2.1外周血单核细胞TLR4 mRNA检测方法取3 mL静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法处理后提取单个核细胞。加入脂多糖1 μg/mL，置于DMEM完全培养基中，5% CO2、37℃培养6 h。取培养后的细胞悬液1 mL，采用TRIzol一步法提取总mRNA;逆转录成cDNA，用荧光定量PCR法测定TLR mRNA。反应条件: 94℃预变性5 min后，94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，循环30次; 72℃延伸5 min，4℃5 min。引物由大连宝生物公司设计并合成，上游引物5'-GGTGGAAGTTGAACGAAT-3'，下游引物5'-AGATGATACCGCACGAC-3'。取PCR产物置于2%琼脂糖凝胶中，120 V电压电泳30 min，拍照。计算β-acttin与TLR4的光密度比值，以此作为TLR4 mRNA的相对表达量。

1.2.2炎性指标检测方法取空腹肘静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管中;以3 000 r/min离心10 min，分离血清备用。采用德国Bayer公司的全自动生化分析仪检测CRP，采用ELISA法检测IL-8、TNF-α。

1.2.3统计学方法采用SAS8.2统计软件。计量资料以珋x±s表示，采用方差分析;相关关系采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1两组外周血单核细胞TLR4 mRNA及血清 CRP、IL-8、TNF-α比较见表1。

表1　两组外周血单核细胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α比较(±s)

注:与对照组比较，aP＜0.05;与SDM患者比较，bP＜0.05;与EDM患者比较，cP＜0.05。

组别　n　TLR4 mRNA　TNF-α(ng/mL)　IL-8(ng/mL)　CRP(g/L) T2DM 组SDM　46　0.41±0.14a　14.48±4.17a　11.91±2.04a　2.83±1.34aEDN　58　0.62±0.23ab　15.82±5.39a　12.13±2.58a　3.74±1.87abCDN　45　0.75±0.15abc　21.46±7.68abc　15.53±4.07abc　6.81±3.38abc对照组35　0.29±0.05　9.38±1.34　5.81±0.76　1.47±0.53

2.2外周血单核细胞TLR4 mRNA与血清CRP、IL-8、TNF-α的关系外周血单核细胞TLR4 mRNA的表达与血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相关(r分别为0.653、0.648、0.697，P均＜0.05)。

3　讨论

临床发现，控制血糖、血压、尿蛋白及阻断RAS系统等，仅对DKD有一定延缓作用，无法阻止其进展为终末期肾衰竭［7］。近年来，研究表明炎症反应可作为胰岛素抵抗综合征参与T2DM并发症的发生［8］。Wada等［9］研究认为，持续性低浓度炎症反应与细胞外基质的累积是DKD进展的共同通路，阐明炎症分子作用机制有望成为DKD新治疗靶点。

TLR4作为具有跨膜信号转导功能的膜结合受体，对激活固有免疫及适应性免疫反应有主导作用，可介导细菌内毒素诱导的炎症反应，促进炎性因子的合成与释放［10］。肾脏局部的炎症反应可诱导外源性的淋巴细胞、单核/巨噬细胞趋化、聚集，进一步加剧肾脏的炎性损伤，而这些细胞中均有高水平的TLR4表达［11］。本研究结果显示，T2DM组外周血单核细胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α均升高，且随着病情的加重TLR4 mRNA逐渐增加，说明TLR4表达水平与DKD的病情呈正相关，且对病情的敏感性高于炎性因子指标，也提示TLR4及其信号传导通路可能在DKD的发病中起到重要作用。相关性分析显示，外周血单核细胞TLR4 mRNA表达与血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相关。其可能的机制是多种内(外)源性的炎性因子依赖TLR4发挥作用，TLR4通过增加炎性因子产生分泌介导肾脏炎性损伤［12，13］。Kaur等［14］研究发现，TLR4基因缺陷小鼠的UAER及肾功能明显改善，抑制DKD的进展，且这一作用独立于血糖水平。Cha等［15］利用TLR信号通路抑制剂GIT27研究其对DKD小鼠模型肾脏保护作用，发现GIT27可降低促炎症细胞因子的合成，改善氧化应激，减轻肾小球硬化，降低UAER。因此，干预TLR4信号通路激活可能有助于控制DKD的病情，但阻断TLR信号通路能否成为DN治疗的靶点尚需进一步研究证实。

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(收稿日期:2014-12-04)

通信作者:冯波，E-mail: fengbo@ medmail.com.cn

文章编号:1002-266X(2015) 20-0083-02

文献标志码:B

中图分类号:R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.034