雌激素对兔缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞凋亡的影响及其机制探讨

葛嫣然，邵宏超，王福海(河北联合大学附属医院，河北唐山063000;青县人民医院)

雌激素对兔缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞凋亡的影响及其机制探讨

葛嫣然1，邵宏超1，王福海2
(1河北联合大学附属医院，河北唐山063000;2青县人民医院)

摘要:目的观察雌激素对兔缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法55只健康纯种大耳白兔随机分为假手术组(n=5)、缺血组(n=25)和治疗组(n=25)。治疗组皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d;缺血组给予等量生理盐水皮下注射。假手术组仅进行前房穿刺，缺血组与治疗组建立缺血再灌注模型。各组于再灌注后3、6、12、24、72 h，通过TUNEL法检测视网膜组织神经节细胞凋亡，免疫组化SABC法检测视网膜组织Caspase-3。结果假手术组各时间点视网膜组织均未见神经节细胞凋亡和Caspase-3阳性表达。与缺血组比较，治疗组视网膜神经节细胞凋亡阳性细胞数、Caspase-3阳性细胞数在再灌注后各时间均降低，其中12、24、72 h有统计学差异(P均＜0.01)。结论雌激素可通过降低缺血再灌注损伤时Caspas-3表达，抑制视网膜神经节细胞凋亡，实现其对视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用。

关键词:视网膜;缺血再灌注损伤;雌激素;视网膜神经节细胞;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶;凋亡

视网膜缺血再灌注损伤是临床常遇到的眼科病理改变形式之一，常见于视网膜血管阻塞性疾病、青光眼、眼科手术、眼外伤等，可以导致视网膜神经组织的损伤，引起视力障碍甚至失明。目前，视网膜缺血再灌注损伤的确切发病机制尚不完全清楚，最近研究发现，凋亡是视网膜缺血再灌注损伤神经细胞死亡的主要形式之一［1］，也是视网膜神经细胞变性的最后共同途径。2012年6月～2013年8月，本研究建立了兔视网膜缺血再灌注损伤模型，通过观察雌激素对兔缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞凋亡的影响，分析其治疗机制，旨在为指导临床治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料55只健康纯种大耳白兔，购于北京实验动物中心，随机分为假手术组(n=5)、缺血组(n=25)、治疗组(n=25)。苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，Caspase-3抗体、SABC试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、DAB显色剂、多聚赖氨酸、枸橼酸缓冲液、PBS(武汉博士德生物工程有限公司)，氯霉素滴眼液(唐山红星药业有限公司)，红霉素眼药膏(唐山红星药业有限公司)，平衡盐溶液(河北天成药业有限公司)，倍诺喜滴眼剂(日本参天制药株式会社)，托品酰胺滴眼剂(北京双鹤现代医药技术有限责任公司)，4%多聚甲醛(天津傲然精细化工研究所)，20%乌拉坦(天津傲然精细化工研究所)，中性树脂(唐山医疗试剂公司)乙醇、二甲苯、伊红、苏木素、0.5%盐酸乙醇、1%氨水(河北联合大学病理教研室)，3%过氧化氢水溶液(天津灏洋生物技术公司)。

1.2方法

1.2.1治疗方法治疗组皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，缺血组给予等量生理盐水皮下注射，共7 d。

1.2.2缺血再灌注损伤模型制作假手术组仅进行前房穿刺，缺血组与治疗组建立缺血再灌注模型，以20%乌拉坦5 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，兔眼滴用倍诺喜表面麻醉。复方托品酰胺滴眼液散瞳后，将连接生理盐水的5号头皮针从耳前方角巩膜缘内刺入前房，缓慢升高输液瓶高度产生16.7 kPa压力，观察并监测眼睛情况。缺血时可见球结膜苍白、虹膜迅速变白，检眼镜检察可观察视网膜苍白水肿，说明视网膜中央动脉的供血已被完全阻断。60 min后逐渐降低输液瓶高度，缓慢降低眼内压，恢复视网膜血供。假手术组，复方托品酰胺滴眼液散瞳后，用5号头皮针从耳前方角巩膜缘内刺入前房，之后缓慢拔除针头。

1.2.3标本制作各组于再灌注损伤后3、6、12、

24、72h耳缘静脉快速注入空气栓塞处死，迅速摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定24 h;去除角膜、虹膜、晶状体及玻璃体，将后段眼环再固定4 h，进行梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，包埋，切片。

1.2.4视网膜神经节细胞凋亡检测采用TUNEL法。每只眼球取2张切片进行分析，用图像分析计数系统对凋亡神经节细胞切片进行图像分析。在图像分析仪上对待测样本取样，在视网膜切片中央部位向两侧各取2个连续不重叠的高倍视野，分别计数阳性细胞数，计算平均数。

1.2.5视网膜Caspase-3表达检测采用免疫组化SABC法。按试剂盒说明进行操作，细胞质染成棕黄色为蛋白阳性表达。在视网膜切片中央部位向两侧各取2个连续不重叠的高倍视野(HP)，计数每个视野阳性细胞数，计算平均数。

1.2.6统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组视网膜神经节细胞凋亡比较假手术组各时间点均无视网膜神经节细胞凋亡;缺血组与治疗组各时间点视网膜神经节细胞凋亡比较见表1。

表1　缺血组与治疗组缺血再灌注后不同时间点视网膜神经节细胞凋亡比较(个，±s)

组别　n视网膜神经节细胞凋亡3 h　6 h　12 h　24 h　72 h缺血组　25　9.60±2.37　16.00±2.91　22.90±3.70　33.70±6.73　23.20±3.82治疗组　25　7.20±3.12　12.80±3.16　17.30±3.68　20.00±2.71　17.90±3.67 t 1.94　2.36　3.39　5.97　3.16 P 0.068　0.030　0.003　0.000　0.005

2.2各组视网膜组织Caspase-3阳性细胞表达比较假手术组未见Caspase-3阳性细胞表达，缺血组与治疗组各时间点视网膜组织Caspase-3阳性细胞表达比较见表2。

表2　缺血组与治疗组缺血再灌注后不同时间点视网膜组织Caspase-3阳性细胞比较(个，±s)

组别　n Caspase-3阳性细胞3 h　6 h　12 h　24 h　72 h缺血组　25　15.90±2.33　28.80±4.24　55.20±6.07　101.60±11.44　61.80±8.05治疗组　25　14.10±1.79　21.10±3.31　44.80±7.08　72.50±5.93　48.20±8.66 t 1.94　4.53　3.53　7.14　3.64 P 0.069　0.000　0.002　0.000　0.002

3　讨论

雌激素是一类维持机体正常生理状态的重要性激素。动物实验及临床研究结果显示，雌激素对急性缺血、缺氧性神经损伤具有明显的神经保护作用［2～8］。Nonaka等［9］发现，炎症反应参与了大鼠视网膜缺血再灌注损伤过程，应用雌激素后白细胞在缺血视网膜内聚集减少约35.7%，再灌注时神经组织损伤程度也明显减轻，表明雌激素可以减轻视网膜缺血再灌注损伤时的炎症反应。代艳等［10］观察大鼠缺血再灌注前后视网膜内层厚度，采用TUNEL法检测视网膜组织中凋亡细胞的表达，发现雌激素治疗组视网膜内层萎缩变性程度较轻，神经节细胞凋亡数量减少，表明雌激素对缺血再灌注损伤具有保护作用。

本研究采用TUNEL法观察视网膜神经节细胞凋亡的变化，用免疫组化方检测了兔视网膜缺血再灌注后Caspase-3表达变化。结果发现，假手术组未见视网膜神经节细胞的凋亡;缺血组在缺血再灌注后6 h凋亡细胞表达逐渐增多，至24 h达高峰，72 h凋亡细胞明显减少;治疗组各时间点细胞凋亡数量均较缺血组明显减少，这一变化基本符合国内外文献报道的细胞凋亡出现的规律，也证实了细胞凋亡与视网膜缺血再灌注损伤密切相关［11～15］。说明雌激素能够减少视网膜缺血再灌注后视网膜神经节细胞的凋亡。Caspases是一组对底物门冬氨酸有特异水解作用的蛋白酶，至今己发现15个家族成员，其中多数的Caspases与细胞凋亡密切相关［16，17］。本研究中，假手术组未见Caspase-3阳性细胞表达;缺血组Caspase-3在缺血再灌注3 h即开始少量表达，至12 h表达明显，主要位于神经节细胞层和内核层，24 h达到高峰，以神经节细胞层和内核层为著，外核层亦可见少量表达，再灌注72 h Caspase-3表达明显下降;治疗组再灌注6 h Caspase-3开始少量表达，12～72 h表达变化趋势基本同损伤组，但各时间段Caspase-3阳性细胞的表达明显减弱，两组再灌注12、24、72 h比较有统计学差异。表明雌激素可以下调Caspase-3的表达，减轻细胞凋亡。Jover等［18］在动物大脑缺血性模型中也发现，雌激素可抑制Caspase-3的活性，从而阻断了凋亡信号级联，抑制细胞凋亡。

综上所述，雌激素可以通过下调Caspase-3的表达，减轻视网膜缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡，对视网膜缺血再灌注损伤起到保护作用，但相关雌激素给药剂量及方式需进一步探讨。

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(收稿日期:2014-08-28)

通信作者:邵宏超，E-mail: shaohongchao@126.com

基金项目:河北省唐山市科技计划项目(12140209A-47)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0028-03

文献标志码:A

中图分类号:R774.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.009