登革2型病毒NS1基因真核表达载体的构建及意义

何莉，易小芳，罗春华(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443000)

登革2型病毒NS1基因真核表达载体的构建及意义

何莉，易小芳，罗春华
(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443000)

摘要:目的构建登革2型病毒( DENV2) NS1基因的真核表达载体，为筛选与NS1相互作用的蛋白以及研究机体抵抗登革病毒感染的作用机制奠定基础。方法以DENV2感染THP1细胞的cDNA为模板，采用RT-PCR法扩增具有Flag标签的NS1全长基因，并将其克隆至pSG5质粒中，构建pSG5-NS1-Flag真核表达载体。筛选阳性克隆，分别进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将真核表达载体分别转染293T细胞和A549细胞，Western blotting法检测细胞NS1蛋白表达。结果扩增后具有Flag标签的NS1全长基因片段大小为1 089 bp，与预期目的片段大小相符。载体和目的基因NS1都含1个ECORⅠ位点，单酶切片段大小分别为463、4 722 bp，NS1扩增片段和pSG5质粒的双酶切片段大小分别为1 089、4 100 bp; 6个阳性克隆中，5、6号克隆酶切片段符合预期大小，并经序列鉴定证实。293T细胞和A549细胞转染空载体后，NS1融合蛋白表达极低，转染真核表达载体后均有NS1融合蛋白表达。结论本研究成功构建了pSG5-NS1-Flag真核表达载体，为与NS1相互作用的免疫调控蛋白、NS1蛋白翻译后修饰以及机体免疫系统抵御登革病毒感染机制的相关研究奠定了基础。

关键词:登革病毒，2型; NS1;真核表达

Construction of dengue virus serotype2 NS1 eukaryotic expression vector and its significance

HE Li，YI Xiao-fang，LUO Chun-hua
( The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443000，China)

Abstract:Objective To construct a eukaryotic expression vector of dengue virus serotype2( DENV2) NS1 gene，and to lay the foundation for screening the protein which was interacting with NS1 and for the mechanism of being against the dengue virus infection.Methods NS1-Flag sequence was amplified from the DENV2-infected THP1 genomic DNA by RTPCR and cloned into pSG5 plasmid to construct the pSG5-NS1-Flag eukaryotic expression vector.Positive clones were screened and then were identified by the enzyme digestion and sequencing.The eukaryotic expression vector was transfected into 293T cells and A549 cells by lipofection transfection.The expression of NS1 protein was detected by Western blotting.Results The full-length gene fragment size of NS1after amplification which had the Flag label was 1 089 bp，and was consistent with the expected one.The carrier and NS1 gene both contained 1 of ECORⅠsite，the single enzyme fragment sizes were 463 and 4 722 bp，respectively; the amplified fragment size of NS1 and the double enzyme fragment size of pSG5 plasmid were 1 089 and 4 100 bp，respectively.During the six positive clones，the target bands of clone 5 and clone 6 were consistent with the expected results and were identified by sequence identification.The NS1 fusion protein expression was extremely low after 293T cells and A549 cells were transfected by empty vector，after the transfection of eukaryotic expression vector，there was the NS1 protein expression.Conclusion The pSG5-NS1-Flag eukaryotic expression vector is successfully constructed，which paves the way for studying interaction between NS1 and immunomodulatory protein，post-translational modification and the mechanism of the body's immune system against dengue virus infection.

Key words:dengue virus，serotype 2; NS1; eukaryotic expression

据WHO统计，目前有超过25亿人生活在登革病毒( DENV)感染区，登革热已成为世界上严重的虫媒传染病之一［1］。DENV属于黄病毒科黄病毒属，共分为4个血清型( DENV1～4)［2］，其国际参考株分别是登革1～4型病毒株，主要由感染的埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬敏感脊椎动物宿主而传播。DENV的基因组为单股正链RNA，长度约为10 kb，依次编码3种结构蛋白(包括衣壳蛋白、膜蛋白及其前体、包膜蛋白)和7种非结构蛋白( NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)［3］。NS1蛋白是惟一能同时在细胞表面表达并分泌到细胞外的非结构蛋白，具有强免疫原性［4］。研究表明，NS1蛋白在DENV感染和免疫过程中发挥着重要作用［5］。2013 年2月～2014年3月，我们构建了DENV2的NS1基因真核表达载体(具有Flag标签)，并在人真核细胞中进行了表达验证，以期为后续筛选与NS1相互作用的蛋白以及研究机体抵抗DENV感染作用机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料DENV2由广州市疾病预防控制中心提供。THP-1细胞、人真核细胞( 293T细胞、A549细胞)、PFU高保真聚合酶、质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectami-neTM2000均购自美国Invitrogen公司，T4 DNA连接酶和限制性内切酶均购自美国NEB公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体、小鼠抗Flag单克隆抗体均购自美国Sigma公司，蛋白电泳、SDS-PAGE胶、Western blotting试剂和蛋白marker均购自美国BIO-RAD公司。

1.2 pSG5-NS1-Flag真核表达载体的构建THP-1细胞培养于含10% FBS和1%抗生素的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO2。以DENV2感染THP1细胞的cDNA为模板，采用RTPCR法扩增具有Flag标签的NS1全长基因。根据NS1基因序列( GenBank序列号为U87411.1)，设计一对扩增NS1基因全长阅读框引物，上游引物: 3'-CGCGGATCCATGGATAGTGGTTGCGTTGT-5'，BamHⅠ酶切位点为GGATCC部分;下游引物: 3'-CCGCTCGAGCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCACCACCACCAGCTGTGACCAAGGAGTT-5'，XhoⅠ酶切位点为CTCGAG部分，Flag标签为CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC部分，Gly铰链为ACCACCACC部分。PCR反应体系为50 μL，扩增反应条件: 94℃2 min，94℃15 s，50～60℃30 s，68℃100 s，共36个循环; 68℃延伸10 min。对PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化。按照试剂盒操作说明进行质粒提取及DNA片段胶回收，将PCR扩增产物克隆至pSG5质粒中构建pSG5-NS1-Flag真核表达载体，转化感受态细胞后筛选阳性克隆。

1.3酶切及序列鉴定对阳性克隆进行ECORⅠ单酶切鉴定，将NS1扩增片段和pSG5质粒分别用BamHⅠ和XhoⅠ剪切酶进行双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳回收片段后进行连接，转化后挑取菌落进行酶切鉴定。将酶切鉴定符合标准的阳性克隆送往上海英韦创津生物技术有限公司进行序列鉴定，验证插入片段序列。

1.4细胞培养及载体瞬时转染采用含5% FBS 和1%抗生素的DMEM培养基培养293T细胞和A549细胞，培养箱条件为37℃、5% CO2。取对数生长期的293T细胞和A549细胞，分别接种于12孔板中(每孔3×105个细胞)，细胞贴壁后采用脂质体转染法按照Lipofectami-neTM2000操作说明将pSG5-NS1-Flag质粒DNA与Lipofectami-neTM2000混合物( 2.5 μL/μg)转染至细胞，24 h后收获细胞。

1.5细胞NS1蛋白表达检测采用Western blot ting法。将空载体及不同质量( 0.1、0.2、0.3 μg)的重组质粒瞬时转染于293T细胞中，将空载体及不同质量( 0.2、0.3、0.4 μg)的重组质粒瞬时转染于A549细胞中。转染后24 h，用细胞裂解液充分裂解293T细胞及A549细胞，Bradford法测定裂解物总蛋白浓度。取40 μg裂解物蛋白与4×上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min。采用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶，按80 V 30 min、120 V 60 min先后进行电泳;蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。4℃孵育一抗过夜，PBST按10 min/次洗涤3次;室温孵育二抗2 h，PBST按10 min/次洗涤3次。进行化学发光，暗室X片曝光显示实验结果。

2　结果

2.1 pSG5-NS1-Flag载体的酶切及序列鉴定结果扩增后具有Flag标签的NS1全长基因片段大小为1 089 bp(见插页Ⅰ图1)，与预期目的片段大小相符。载体和目的基因NS1都含1个ECORⅠ位点单酶切片段大小分别为463、4 722 bp，NS1扩增片段和pSG5质粒的双酶切片段大小分别为1 089、4 100 bp; 6个阳性克隆中，5、6号克隆酶切片段符合预期大小，见插页Ⅰ图2。5、6号克隆酶切片段经序列鉴定证实，NS1插入片段与GenBank中的序列( U87411.1)完全吻合。

2.2 NS1蛋白在293T细胞中的表达转染空载体的293T细胞中NS1融合蛋白表达极低，而转染了0.1、0.2、0.3 μg重组质粒的293T细胞中均有NS1融合蛋白显著表达。见插页Ⅰ图3。

2.3 NS1蛋白在A549细胞中的表达转染空载体的A549细胞中NS1融合蛋白表达极低，而转染了0.2、0.3、0.4 μg真核表达载体的A549细胞中均有NS1融合蛋白表达，其中转染0.3 μg真核表达载体的NS1融合蛋白表达条带信号最强。见插页Ⅰ图4。

3　讨论

由于目前缺乏有效的防控措施，且临床上仍没有研发出安全有效的疫苗和治疗方法，DENV感染已成为全球性的严重公共卫生问题［6］。文献报道，NS1蛋白是DENV的一种重要非结构蛋白，具有高度保守的特点。NS1蛋白的同源二聚体与膜系统结合［7］，可能参与病毒基因组复制;其同源六聚体以可溶性形式分泌于胞外，可诱导机体产生抗体［8，9］。但是关于NS1蛋白在DENV感染中的具体作用机制，仍有待进一步研究。

Flag蛋白是最常用的标签蛋白之一，通过将目的基因与Flag蛋白基因融合后作为融合蛋白而表达。本研究以DENV2感染THP1细胞的cDNA为模板，采用RT-PCR法扩增具有Flag标签的NS1全长基因，并将其克隆至pSG5质粒中，成功构建pSG5-NS1-Flag真核表达载体［10］，并通过酶切及DNA测序分析证实其正确性。因为293T细胞的转染效率高，常被用作研究蛋白相互作用的一种工具细胞;而A549细胞作为DENV敏感的真核靶细胞，也具备较高的转染效率。本研究选择了这两种细胞作为转染对象，结果发现两种细胞转染空载体后NS1融合蛋白表达极低，而转染真核表达载体后均有NS1融合蛋白表达，验证了载体表达的正确性。

对病毒蛋白的蛋白质翻译后修饰是目前国际上热门的研究方向，如SUMO化修饰就是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰［11］。近年来，越来越多的病毒蛋白被证实为SUMO化修饰的底物蛋白［12］，且SUMO化修饰通过不同的机制来影响病毒复制［13］。基于SUMO化修饰在病毒和宿主细胞相互作用中的重要性，因此对DENV蛋白SUMO化修饰的深入研究是极其有意义的［14］。本研究发现，随着转染质量的增加，293T细胞中均有NS1融合蛋白显著表达，因此可以选择最小质量0.1 μg进行后续实验; 而A549细胞中转染0.3 μg真核表达载体的NS1融合蛋白表达条带信号最强，可以选择该质量进行后续实验。

综上所述，本研究成功构建了pSG5-NS1-Flag真核表达载体，为后续研究与NS1相互作用的免疫调控蛋白［15］、NS1蛋白的蛋白质翻译后修饰以及阐明机体免疫系统抵御DENV感染的具体作用机制奠定了实验基础。

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收稿日期:( 2015-06-15)

通信作者简介:罗春华( 1972-)，男，主任技师、硕士研究生导师，研究方向为临床实验诊断学。E-mail: lchlgj2004@ aliyun.com

作者简介:第一何莉( 1988-)，女，技师，主要从事抗感染免疫的临床工作。E-mail: helishelly@163.com

基金项目:湖北省教育厅自然科学基金资助项目( D20131308)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0008-03

文献标志码:A

中图分类号:R373.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.003