食管鳞状细胞癌组织P16基因启动子区CpG单位甲基化状态检测及意义

刘芳，康雪，刘晓燕，张宁，齐翠花，黎永军，郑勇，陈卫刚(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000)

食管鳞状细胞癌组织P16基因启动子区CpG单位甲基化状态检测及意义

刘芳，康雪，刘晓燕，张宁，齐翠花，黎永军，郑勇，陈卫刚
(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000)

摘要:目的探讨食管鳞状细胞癌组织P16基因启动子区CpG单位的甲基化与其发病的关系。方法收集食管鳞状细胞癌标本35份(观察组)和正常食管组织46份(对照组)，采用MassARRAY甲基化DNA定量分析技术检测两组P16基因启动子区19个CpG单位的甲基化状态，秩和检验比较两组CpG单位的甲基化率。结果观察组P16基因启动子区CpG单位总甲基化率为9.06%±7.11%，对照组为8.48%±6.34%;两组比较，P＞0.05。观察组P16基因启动子区CpG11-12位点甲基化率为11.34%±8.47%，对照组为7.25%±5.60%;两组比较，P＜0.05;两组其余18个CpG单位甲基化率比较，P均＞0.05。结论P16基因启动子区CpG11-12位点的甲基化可能与食管鳞状细胞癌的发病有关。

关键词:食管鳞状细胞癌; P16基因; CpG单位;甲基化

Detection and significance of CpG unit methylation in P16 gene promoter region of esophageal squamous cell carcinoma

LIU Fang，KANG Xue，LIU Xiao-yan，ZHANG Ning，QI Cui-hua，LI Yong-jun，ZHENG Yong，CHEN Wei-gang
( The First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University，Shihezi 832000，China)

Abstract:Objective To detect the CpG unit methylation in the P16 gene promoter region of esophageal squamous cell carcinoma tissues and the significance.Methods We collected 35 cases of esophageal squamous cell carcinoma samples ( observation group) and 46 cases of normal esophageal tissues ( control group).We used MassARRAY methylation DNA quantitative analysis technology to detect the methylation status of 19 CpG units of P16 gene promoter region，and we used Rank test to compare the CpG methylation rates of the two groups.Results The 19 CpG unit methylation rates in the P16 gene promoter region of the observation group and control group were 9.06%±7.11% and 8.48%±6.34%，respectively.No significant difference was found between the two groups，P＞0.05.The methylation rate of P16 gene in ESCC of CpG unit 11-12 was 11.34%±8.47% in the observation group，and 7.25%±5.60% in the control group ( P＜0.05) ; and no significance was found in the methylation rate of other 18 units between the two groups ( all P＞0.05).Conclusion The methylation of CpG11-12 site in the P16 gene promoter region may be associated with the esophageal squamous cell carcinoma.

Key words:esophageal squamous cell carcinoma; P16 gene; CpG unit; methylation

我国食管癌具有十分明显的地区性分布特点，其中新疆伊犁哈萨克自治州是高发区之一［1，2］。P16基因是1993年由Serrano和Beach等发现的位于人类9号染色体的抑癌基因［3］，其甲基化可发生于肺癌、乳腺癌、口腔鳞癌等多种肿瘤中［4～6］，但目前关于食管鳞状细胞癌P16基因甲基化的研究较少。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，在基因组某些区段中的表达高于正常概率，这些区段被称作CpG岛，其主要位于基因的启动子和第一外显子区域。以往的研究证实，基因启动子区高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤的共同特征之一。因此，我们采用MassARRAY甲基化DNA定量

分析技术检测食管鳞状细胞癌组织P16基因启动子区19个CpG单位的甲基化情况，现分析结果并探讨其意义。

1　材料与方法

1.1材料35份食管鳞状细胞癌标本(观察组)、46份正常食管组织标本(对照组)均由2011年1月～2012年12月新疆哈萨克族自治州新源县人民医院收集并均经病理检查确定诊断。观察组患者男17例、女18例，年龄40～70岁、中位年龄55岁;均未经过放化疗及药物治疗;分化程度为高分化12例，中分化13例，低分化10例。对照组患者男22例、女24例，年龄40～70岁、中位年龄55岁。两组性别、年龄均具有可比性。QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购于德国QIAGEN公司，蛋白酶K购于Merck公司，焦碳酸二乙酸购于德国Sigma公司。DM-86L26型超低温保存箱购于中国Haier公司，TP650 型PCR循环仪购于日本TaKaRa公司，042BR11269型水平式电泳仪、GEL-DOC2000型凝胶图象成像仪均购于美国BIO-RAD公司，ZF型紫外分析仪购于上海康华生化仪器制造厂。

1.2食管组织P16基因启动子区CpG单位甲基化检测采用MassARRAY甲基化DNA定量分析技术。按照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明书分别提取两组总DNA 50 μL，应用β-actin对提取的DNA质量进行检测。紫外分光光度计检测DNA浓度，合格样品标准:①浓度＞75 ng/μL;②总量≥1 μg;③电泳主带明显且没有降解;④A260/A280为1.7～2.1。将检验合格的DNA置于－20℃冰箱保存，对DNA样品进行亚硫酸盐处理，严格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒说明书操作。对样本进行PCR扩增，P16基因启动子区上游引物: 3'-AGGAAGAGAGGTTAGGAGGAGGTTTGTGATTAT-5'，下游引物: 3'-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCCCCTTACCTAAAAAAATACC-5'，扩增长度442 bp，所有引物由上海生物有限公司设计。PCR扩增产物经过碱性磷酸酶处理及纯化，使用点样仪将纯化后的产物点至384孔SpectroCHIP芯片上，将点制好的芯片放入MassARRAY Compact System，采用MALDI-TOF技术进行检测。EpiTYPER软件对数据进行分析，并输出19个CpG单位的甲基化率。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用两独立样本的Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组P16基因启动子区CpG单位总甲基化率比较观察组P16基因启动子区CpG单位总甲基化率为9.06%±7.11%，对照组为8.48%±6.34%;两组比较，P＞0.05。

2.2两组P16基因启动子区19个CpG单位的甲基化率比较观察组和对照组CpG_1甲基化率分别为8.24%±5.21%、9.12%±6.08%，CpG_3甲基化率分别为9.82%±15.14%、7.20%±12.51%，CpG_4甲基化率分别为29.05%±21.55%、25.65%±20.85% CpG_5-6甲基化率分别为9.60%±8.00%、8.75%± 5.62%，CpG_7甲基化率分别为8.24%±5.21% 9.12%±6.08%，CpG_8-9甲基化率分别为9.60%± 8.00%、8.75%±5.62%，CpG_10甲基化率分别为6.16%±9.50%、8.38%±13.46%，CpG_13-14甲基化率分别为8.67%±7.48%、5.78%±4.53%，CpG_ 15-16甲基化率分别为3.00%±4.57%、3.73%± 6.39%，CpG_17甲基化率分别为6.16%±9.50% 8.38%±13.46%，CpG _18-21甲基化率分别为14.19%±9.23%、14.34%±7.45%，CpG_22甲基化率分别为2.60%±4.42%、2.56%±5.25%，CpG_ 23-25甲基化率分别为23.73%±10.15%、22.55% ±8.19%，CpG_30-31甲基化率分别为1.80%± 3.16%、2.20%±2.96%，CpG_32甲基化率分别为2.60%±4.42%、2.56%±5.25%，CpG_33-35甲基化率分别为9.58%±7.12%、7.00%±4.22%，CpG _38甲基化率分别为5.42%±6.15%、5.34%± 5.89%，CpG _39-40甲基化率分别为1.80%± 3.16%、2.20%±2.96%;两组比较，P均＞0.05观察组和对照组CpG _11-12甲基化率分别为11.34%±8.47%、7.25%±5.60%，两组比较，P＜0.05。

3　讨论

食管鳞状细胞癌是我国常见的恶性肿瘤，其致病原因目前尚未明确，研究显示其发病可能与饮用热水、食用含亚硝酸盐食物及遗传因素等有关。有研究证实，遗传学和表观遗传学的改变是食管癌发病的主要机制，而抑癌基因启动子区高甲基化是表观遗传修饰的主要方式［7，8］。P16蛋白可抑制细胞的生长、增殖，失活后最终可引起肿瘤发生［9］。余炜伟等［10］发现，P16基因高甲基化后会降低蛋白的表达。刘清等［11］研究发现，肿瘤的形成受抑癌基因启动子区甲基化的影响。以上均说明P16基因启动子区高甲基化可能与肿瘤的发生有关。赵燕等［12］研究发现，P16基因启动子区高甲基化是新疆哈萨克族、汉族食管癌发病的高危因素。而本研究中两组P16基因启动子区CpG单位总甲基化率比较无

统计学差异，与以往研究结论不一致，考虑与样本量过少或研究方法不同有关，本研究结论仍需扩大样本进一步证实。

本研究共检测了P16基因启动子区的19个CpG单位，发现观察组P16基因启动子区CpG_11-12位点甲基化率显著高于对照组，说明P16基因启动子区CpG_11-12位点甲基化可能与食管鳞状细胞癌的发病有关。CpG_11-12位点甲基化后引起P16基因缺失，蛋白表达水平随之降低，其抑制肿瘤细胞增殖的作用减弱，导致肿瘤细胞大量增殖，最终引起食管癌的发生［13］。

研究表明，基因异常甲基化这一过程可以逆转，对癌前病变患者或肿瘤患者进行去甲基化处理可达到恢复抑癌基因功能的目的。杨婷等［14］对食管癌细胞株应用基因甲基化转移酶抑制剂( DNMT) 5-杂氮-2'脱氧胞苷进行处理，使甲基化的抑癌基因重新表达，从而抑制食管癌细胞株生长。也有研究将野生型P16基因导入肿瘤细胞，代替失活的P16基因，从而发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用［15］。但是DNMT抑制剂特异性低，可能会引起处于抑制状态的癌基因激活，促进肿瘤的发生。目前，DNMT抑制剂仅在理论上可能具有去甲基化作用，并没有应用于临床，下一步我们研究的重点为去甲基化剂的作用机制及应用效果。

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收稿日期:( 2014-01-10)

通信作者简介:陈卫刚( 1968-)，男，主任医师，主要从事消化道肿瘤的诊疗工作。E-mail: cwgsh@126.com

作者简介:第一刘芳( 1980-)，女，主治医师，主要从事消化道肿瘤的诊疗工作。E-mail: 1051584797@ qq.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81260362) ;石河子大学医学院基础与临床医学联合科研基金资助项目( LHJJ2010B04)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0005-03

文献标志码:A

中图分类号:R735.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.002