Rho/ROCK通路在脊髓损伤后神经轴突再生中的研究进展

丁李立强，何兴伟，闵友江

（1.江西中医药大学，南昌 330006；2.江西中医药大学附属医院，南昌 330006）

·综 述·

Rho/ROCK通路在脊髓损伤后神经轴突再生中的研究进展

丁李立强1，何兴伟2，闵友江2

（1.江西中医药大学，南昌 330006；2.江西中医药大学附属医院，南昌 330006）

通过介绍Rho/ROCK信号通路的相关概念及其对神经轴突再生的影响和作用机制，为研究通过抑制此信号通路来促进神经的再生及功能的恢复，从而进一步为临床治疗神经损伤及其他神经系统疾病提供理论依据。

Rho/ROCK；脊髓损伤；神经再生；针灸疗法

Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出来的蛋白，它们是一组相对分子质量大约为20～30 kd的三磷酸鸟苷（guanosine t riphosphate，GTP）结合蛋白，又称小分子量G蛋白，因具有GTP酶活性，习惯被称为Rho GTP酶（Rho GTPases）。Rho族蛋白最主要的功能是调节肌动蛋白和细胞骨架的重组，从而调节细胞的形态变化和运动，Rho可以通过其下游效应因子Rho激酶（ROCK或 Rho-kinase）调节细胞肌动蛋白骨架的重组。有研究表明［1-2］，Rho蛋白及其相关的信号分子通过对细胞骨架的调节，在轴突导向的信号通路中发挥了重要的作用。在脊髓损伤之后，Rho/ROCK信号通路受到神经生长抑制因子作用的影响，而抑制神经轴突的再生。本文就Rho/ROCK信号通路及其对轴突导向和再生的作用做一综述。

1 Rho/ROCK信号通路的基本概念

Rho/ROCK信号通路的关键分子包括Rho、Rho激酶（ROCK）和肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）。Rho是小分子量GTPases超家族Rho亚家族成员，到目前为止已发现 4个亚家族共 18个成员，Rho亚家族分子量约为20～30 kd，根据其序列和功能的不同可分为Rho、Rac和Cdc42亚家族以及不具备GTPase活性的Rho亚家族，各成员间有 50%～55%的同源性。其中哺乳动物的 Rho家族蛋白至少包括 Rho（RhoA、RhoB、RhoC），Rac（Rac1、Rac2、Rac3、RacG），Cdc42（Cdc42H、G25K、TC10），Rnd、RhoD和TTF等。其中研究最多的是Rho、Rac和Cdc42［3］。这些蛋白最主要的功能是调节细胞骨架和肌动蛋白重组，其他功能包括调控基因转录、细胞周期和膜泡运输等。

Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式两种状态存在于细胞质中［4］。Rho受多种细胞因子的调控，鸟苷酸交换因子（GEFs）为 Rho激活剂；GTP酶激活蛋白（GAPs）和GDP解离抑制因子（GDIs）为Rho灭活剂。即Rho-GEF能够使Rho释放GDP并结合GTP；而Rho-GAP却催化GTP的水解使Rho蛋白失活；且Rho GDI可与失活状态的Rho族蛋白（Rho-GDP）结合，使其稳定在失活状态而不能被Rho-GEF活化。在上述分子的调节作用下使 Rho完成两种状态之间的转换，以实现其信号转导过程中的“分子开关”作用。

Rho激酶（ROCK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，以两种同源性极高的异构体存在：ROCKα /ROCKⅠ和ROCKβ/ROCKⅡ，是目前研究最为清楚的Rho下游效应分子。ROCKⅠ主要分布于非神经元的组织，ROCKⅡ则主要分布于大脑、心脏和肌肉。Rho激酶的分子结构包括氨基端的催化结构域、中间结合Rho的α卷曲螺旋结构域和羧基端的催化结构域以及 Cys/ His区。Rho能与Rho激酶的α卷曲螺旋结构域结合，激活Rho激酶［5］。Rho激酶被激活后能够使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，使得肌球蛋白磷酸化程度增高［6］，从而影响肌动-球蛋白系统而导致轴突生长锥的塌陷，抑制轴突生长［7］。

肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin l ight chain phosphatase，MLCP）为 Rho激酶（ROCK）的底物。MLCP的空间结构是由3个亚单位组成，分别为分子量为38 kDa的1型磷酸酶催化亚单位（PPIc），20 kDa功能不明的亚单位（M20）以及130 kDa的肌球蛋白磷酸酶靶标亚单位（myosin phosphatase target subunit，MYPT）。研究发现MYPT家族包括MYPT1、MYPT2、MBS85、MYPT3 和TIMAP［8］。Feng J等［9］研究证实RhoA/Rho激酶信号通路主要通过磷酸化MYPT1第695位和第850位苏氨酸来抑制MLCP的活性。因此，ROCK使MLCP发生磷酸化，磷酸化的肌球蛋白轻链磷酸酶失活后不能将磷酸化的MLC的磷酸基团水解，从而使MLC持续保持磷酸化的状态，导致生长锥的崩解［10］。

2 Rho/ROCK信号通路与轴突导向及生长过程的研究

轴突生长主要发生在生长锥内，实验研究表明，神经元轴突生长、延长与分枝是细胞骨架介导的生物学过程，细胞骨架的动态性、组装与转运是轴突生长的分子基础［11］，调控生长锥内细胞骨架的动态性是调控轴突生长的关键［12-13］，无论哪一种细胞内信号途径要实现对神经元轴突生长的影响，最终都是通过作用于生长锥细胞骨架来实现的［14］。

生长锥是位于轴突远端的膨大，具有高度的结构动态性，按结构与功能的不同分为3部分，P区（周围区）是生长锥边缘部分，为扇形膨大的板状伪足（主要为肌动蛋白网络），其表面伸出许多细小的丝状伪足（主要为肌动蛋白束），通过肌动蛋白的聚合和解聚以及形成的逆流不断伸长和回缩，改变生长锥的生长行为。C区（中央区）位于生长锥的基部，轴突末端相对膨大、变厚的区域，主要细胞骨架是动态性的微管，肌动蛋白丝在该区逐渐减少或消失。其大小与轴突的生长状态有关，快速生长的轴突较细，静止期则较粗大。过渡带位于C区和P区之间，大量的分子马达位于此区，使肌动蛋白收缩形成肌动蛋白弧，与P区肌动蛋白“逆流”协同阻止微管伸入P区［15］。

生长锥中的细胞骨架成分主要包括微管（microtubule）、微丝（actin f i lament，F-actin）和肌球蛋白（myosin）等。微管是由微管蛋白（tubulin）聚合而成，通常只延伸到生长锥的基部，也有少量进入生长锥。微丝是由肌动蛋白单体（G-actin）聚合成的纤维（F-actin），呈束状分布在丝状伪足（f i lapodia）中，而呈网状有序地分布在片状伪足（lamel l ipodia）中。肌球蛋白通常与肌动蛋白结合成束形成张力纤维丝（st ress f iber）。张力纤维一端终止于局部粘联复合物（focal adhesion complex），另一端连接到微管束。

轴突生长的驱动始于轴突生长锥中肌动蛋白不断的聚集和解聚，在生长锥形态发生改变之前，肌动蛋白骨架就不断地发生着聚集和解聚的改变使板状伪足和丝状伪足不断地伸缩，在复杂的环境中驱动轴突沿特定的方向向前延伸，生长锥在遇到导向性信号时会沿着特定的方向生长，当轴突生长锥探测到方向性的信号时，生长锥内的actin成分发生不对称聚合，丝状伪足及片状伪足向一侧优先延伸，而另一侧趋向于回缩；进而轴突内微管也可以主动或被动地朝同侧延伸，使生长方向进一步稳定下来；肌球蛋白在这个过程中通过其收缩引起丝状伪足的回缩，发挥负调控的作用［16］。

生长锥对周围环境极其敏感，其表面受体可识别细胞外基质中或周围细胞上的导向分子，这些导向分子中有的能够吸引生长锥向其生长，有的却是排斥生长锥向其生长，各种导向因子的信号最终通过Rho GTP酶调节轴突生长锥中的细胞骨架成分的重组，Rho及其相关分子在神经系统的发育过程，轴突生长、分化、延伸及突触的形成过程中起重要作用［17］。

在 Rho GTPase家族中，目前了解最清楚的有Cdc42、Rac和RhoA 3种。Cdc42和Rac能够通过调节肌动蛋白促进轴突生长和稳定，激活的 Rac调节细胞周边肌动蛋白丝网络的组装，促进肌动蛋白丝的聚合，介导板状伪足与膜泡的形成；激活的 Cdc42促进肌动蛋白丝的解聚，调节微管的组装与动态性，介导丝状伪足的形成［18］；而RhoA能够通过调节细胞内张力纤维引起生长锥的塌陷（col lapse）和回缩（ret raction）［19］。己知最重要的对生长锥具有调节作用的 RhoA的下游分子是Rho-kinasa/ROCK［20］。离体实验中使用ROCK的特异抑制剂证明 ROCK对生长锥的活动性具有负的调控作用［21］。ROCK磷酸化抑制myosin轻链脂酶（MLCP），以及直接磷酸化 myosinⅡ轻链本身［22］，这些都导致肌球蛋白的收缩性增加，从而引起生长锥的回缩及塌陷［23］。

3 Rho/ROCK信号通路对神经损伤后轴突再生的影响

相关研究表明，脑脊髓损伤及其邻近结构、疤痕组织及 CNS髓磷脂上存在大量的神经生长抑制因子，可以抑制轴突再生［24］，当生长锥接触到髓鞘中的抑制因子后，其细胞骨架结构就会发生变化，继而引起生长锥塌陷、回缩，轴突生长停止。其主要包括3种来源于髓鞘的抑制蛋白：髓鞘相关糖蛋白（MAG）［25］、Nogo［26］和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMGP）［27］。而这些抑制因子均可通过其共同膜受体NgR受体/p75NTR复合体激活细胞内 Rho信号传导系统，引起肌动蛋白骨架的重组和轴突生长锥的塌陷，从而阻断轴突再生过程［28］。除此之外，研究还发现细胞外环境中的许多导向信息分子如溶血磷脂酸（LPA）、凝血酶受体激活蛋白（TRP）、激活后的前列腺素E受体EP3B等均可激活Rho信号转导途径引起生长锥塌陷［29］。由于神经生长锥的崩解、球茎回缩、神经突退缩，使神经生长不可逆性停止。Conrad S等［30］和Erschbamer MK等［31］的实验结果表明尽管在正常脊髓中有RhoA mRNA量低水平表达，但脊髓损伤后8hRhoAmRNA的表达明显升高，3 d后达高峰，并持续高表达4周之久。

在体脊髓损伤实验发现，在损伤区的神经细胞突起处存在大量活化的 RhoA，从而激活 ROCK，研究表明阻断RhoA和ROCK均可以促进轴突生长［32］。Monnier PP等［33］发现一种小分子物质Y-27632不仅可以抑制ROCK活性，还可以阻断硫酸软骨素蛋白多糖的作用。Y- 27632作为ROCK的主要抑制剂，对各种原因导致的神经损伤均具有保护作用，可增加神经元细胞的存活和神经突起的延长［34］。大鼠SCI后鞘内注射Y-27632，可以观察到背侧脊髓轴突生长，且大鼠后肢功能可以得到明显改善［35］。Lingor P等［36］发现Y-27632与CNTF（另一种 ROCK抑制剂）联合使用更有利于神经突起的生长和再生，并有望用于临床治疗各种神经损伤及退行性病变。在使用Rho或者Rock的抑制剂后，如P21，Y27632，fasudi l等，都观察到这些抑制剂可以促进轴突的再生［37］。以上研究表明，细胞内Rho/ROCK通路在介导抑制性信号阻断轴突再生的抑制过程中发挥着重要作用。

4 针灸作用于Rho/ROCK信号通路的研究进展

目前有关针灸作用于Rho信号通路方面的研究尚不多见，谭峰等［38］研究观察电针对脑缺血再灌注不同时间点脑梗死颈髓 Rho-A表达的影响，结果显示电针组颈髓 Rho-A表达较脑梗死组明显降低，提示电针具有抑制Rho/ROCK信号通路的作用，其促进神经功能修复的作用可能与此有关。李凤等［39］研究观察大鼠局灶性脑梗死后大脑皮质Rho-A和ROCK的表达以及电针刺激对其表达的影响，结果显示电针组中Rho-A和ROCK蛋白表达较模型组减少，说明电针抑制梗死区周围抑制因子Rho-A和ROCK的表达，提示电针刺激对局灶性脑梗死大鼠神经功能的改善作用可能与其有关。以上有关电针与 Rho/ROCK信号通路等研究显示电针能够降低神经系统损伤后Rho-A和ROCK蛋白表达，表明电针具有抑制Rho/ROCK信号通路的作用，其促进神经系统受损后功能的恢复可能与此机制有密切的关系。

5 总结

综上所述，Rho族蛋白通过对细胞骨架的调节，在神经轴突的导向及生长方面发挥着重要的作用，而其中Rho/ROCK信号通路则是负调控生长锥的生长。在脊髓损伤后产生的各种神经生长抑制分子通过复杂的信号传递途径共同作用于Rho/ROCK信号通路，引起细胞肌动蛋白骨架的重组影响轴突再生，不利于脊髓损伤后神经功能的恢复。相关研究表明通过使用Rho激酶抑制剂等手段能够抑制此信号通路，从而促进神经的再生及功能的恢复。目前针灸在神经功能的修复方面取得了比较好的疗效。从现代医学的角度对于针灸的作用机制也进行了大量的研究，但针灸对于 Rho/ROCK信号通路作用的研究尚属罕见，对于针灸的作用机制的研究还有相当大的探索空间。研究针灸对于 Rho/ ROCK信号通路的影响及作用机制，对Rho/ROCK信号通路的机理和针灸干预 Rho/ROCK信号通路的作用进行更深入探讨，将为临床治疗神经损伤及其他神经系统疾病提供帮助，也为针灸治疗提供更多的理论依据。

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Advances in the Study of Rho/Rock Pathway in Axonal Regeneration After Spinal Cord Injury

DINGLI Li-qiang1, HE Xing-wei2, MIN You-jiang2.
1.J iangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China; 2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Nanchang 330006,China

This article presents concepts related to Rho/ROCK signal pathway, and its effect on axonal regeneration and the mechanism of its action to provide a theoretical basis for the inhibition of this signal pathway to promote neural regeneration and functional recovery and further for clinical treatment of nerve injuries and other nervous system diseases.

Rho/ROCK; Spinal cord injury; Neural regeneration; Acupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.12.1246

1005-0957（2015）12-1246-04

2015-05-20

国家自然科学基金项目（81360562）

丁李立强（1991 - ），男，2012级硕士生，Emai l：491844285@qq. com

闵友江（1975 - ），男，副主任医师，博士，Email：myj2002@126. com