大黄酸对乳腺癌肿瘤细胞HER-2蛋白表达的影响研究

林劲冠

作者单位:410008 中南大学湘雅医学院;410013 湖南省肿瘤医院



大黄酸对乳腺癌肿瘤细胞HER-2蛋白表达的影响研究

林劲冠

作者单位:410008 中南大学湘雅医学院;410013 湖南省肿瘤医院

【摘要】目的探讨大黄酸对乳腺癌肿瘤细胞HER-2蛋白表达的影响。方法应用免疫细胞化学法，检测EGFR、HER-2蛋白的表达水平变化；MTT检测培养基内癌细胞的增殖，检测其磷酸化、受体PT心通路蛋白的表达水平的变化；在基因转录水平上通过RT-PCR检测HER-2变化。应用流式细胞技术(FACS)检测细胞凋亡和细胞周期。结果赖氨大黄酸(1 mL)可以抑制来源各不相同的乳腺癌细胞系(MDA.MB-231和MCF-7、SK-B-3)、HUVEC (人脐静脉内皮细胞)、卵巢癌SK-OV-3细胞系增殖，IC50的实验使用剂量分别为95 μmol/L 200 mL与85 μmol/L 80 mL和 110 μmol/L 300 mL。在抑制乳腺癌肿瘤细胞的增殖方面RHL接近于大黄酸。对RHL抗肿瘤机制中：SK-Bf-3细胞HER-2、EGFR呈高表达，其产生细胞凋亡机制在于能够抑制HER-2蛋白、EGFR表达及蛋白磷酸化水平，造成癌细胞的p21、p53途径激活。MCF-7细胞HER-2低表达、EGFR高表达，细胞的增殖被抑制原因在于EGFR、下游的Raf/MEK/ERK信号通路磷酸化，其产生协同抗肿瘤效应是由于MCF-7细胞联合紫杉醇等化疗药物的使用诱导的。结论RHL是1种新型抑制剂，能够抑制HER-2、EGFR双靶点上的受体蛋白(酪氨酸激酶)、细胞的增殖、诱导细胞凋亡而发挥其抗癌作用。

【关键词】大黄酸；乳腺癌；HER-2蛋白；肿瘤细胞；影响

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:639～640)

恶性肿瘤是人类健康的第二大杀手，近年来死于恶性肿瘤的人数越来越多，至2000年，肿瘤新发病例超过1000万，全部患者超过2200万。目前，在某些地区，恶性肿瘤已经上升为人类健康头号杀手。近年来，随着免疫学、分子生物学的发展，开发新型抗肿瘤药物将是人类战胜恶性肿瘤的重要手段之一。临床上，靶向药物的研究使得人类在靶向治疗上取得了突破性进展，加深了对肿瘤在形成过程中的相关基因、受体、信号转导等研究[1]。

靶向药物研究包括基因治疗、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤疫苗、靶向蛋白酪氨酸激酶的阻断剂、特定细胞标志物的单克隆抗体，对部分癌基因及癌细胞的遗传学标志药物等[2]。对家族的单克隆抗体表皮生长因子受体(EGFR)和蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)已经成为研究热点。

1材料与方法

1.1试剂

细胞培养基高糖RPMI 1640、DMEM/F12、DMEM购自Gibc0公司；MTT、I型胶原酶和明胶、DMSO (二甲基亚砜)购自Sigma公司；标准胎牛血清、胎牛血清(Gibc0)、特级胎牛血清(Hyclone) 购自TBD公司(中国医学科学院医学生物工程研究所)；RNA提取试剂TRIzol购自Gibco公司。

1.2癌细胞株

人卵巢癌SK-OV-3细胞株购自于中国医学科学院细胞中心；HUVEC来自新生儿脐带内皮。人MCF-7细胞株、乳腺癌SK-Br-3、MDA-MB-23l为本实验室保存。

1.3实验药品

赖氨酸购于北京科海军舟生物科技发展中心；大黄酸，纯度98%，购于南京市青泽医药科技开发有限公司；赖氨大黄酸(1 mL)由本室合成，脐带提供于友谊医院妇产科。

1.4实验方法

1.4.1细胞的复苏、培养于37 ℃水浴中迅速化冻从液氮中取出的冻存细胞，转移至无菌离心管后，以3 ml培养基加入，悬浮细胞。在室温下，1 000 r/min离心无菌离心管10 min后弃除上清液。再加入5 ml含胎牛血清培养基，悬浮细胞。在37 ℃、5%的CO2培养箱中，转至25 cm2方瓶中进行培养。第二天，观察并记录细胞的生长情况，适时更换新鲜细胞培养基，以继续细胞培养。此后以培养基的常规更换方法，更换并对细胞进行分瓶培养。SK-Br-3细胞DMEM高糖培养基中含胎牛血清15%，细胞生长缓慢、EGFR与HER-2表达高，传代一次需3天、一次传瓶2倍。MDA-MB-231、MCF-7细胞生长快、 HER-2表达低、EGFR表达高，传代一次需2天、一次传瓶4～6倍。MCF-7细胞的Ⅰ冲M11640培养基中含胎牛血清10%；MDA-MB-231细胞在DMEM/F12培养基含10%胎牛血清中培养；SK-OV-3卵巢癌细胞DMEM/F12培养基培基10%胎牛血清，细胞生长快、EGFR、HER-2表达低，传代一次需2天、一次传瓶4～6倍[3]。

1.4.2HUVEC细胞的采集、培养在37 ℃温箱环境内，孵育用2～3 ml明胶PBs溶液包被的培养瓶，过夜之后，弃明胶溶液，再以普通的培养液将其冲洗一次[4]。在无菌平皿中置入脐带，以注射器，抽取PBS反复冲洗脐静脉，直至脐带冲洗液清亮。更换注射器，于脐带一端缓缓注入0.1%Ⅰ型胶原酶，待消化液流出于另一端后，止血钳夹住流出端直至脐带注满消化液，止血钳夹住脐带2端。将脐带放置室温下消化25～30 min后，取0.1%Ⅰ型胶原酶脐带消化液，放入离心管内；此外取培养基冲洗脐带血管腔得冲洗液，放入离心管内，以1 000 r/min 进行离心操作，弃离心液上清。完全培养液培养瓶接种悬细胞，培养24 h后更换培养液。细胞生长约90%融合时，用1∶2比例消化传代培养，采用2～5代细胞进行本次研究。

2结果

1 mL可抑制来源各不相同的乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7、SK-B-3)、HUVEC (人脐静脉内皮细胞)、卵巢癌SK-OV-3细胞系增殖，IC50的实验使用剂量分别为95 μmol/L 200 ml和85 μmol/L 80 ml和 110 μmol/L 300 ml。表明对不同的卵巢癌、乳腺癌细胞系，RHL有同等抑制作用，对于HUVEC增殖，RHL比肿瘤细胞的抑制作用弱。实验对RHL、以DMSO做为溶剂的大黄酸，在肿瘤细胞增殖的抑制作用方面进行比较。本结果显示：RHL与大黄酸对肿瘤细胞有增殖抑制作用。

3讨论

近年来，乳腺癌发病呈年轻化趋势，是女性第一位的恶性肿瘤[5]。临床上针对乳腺癌的治疗，有许多方案。目前,对许多肿瘤化疗药，HER-2高表达的乳腺癌细胞都有一定程度的耐药性，乳腺癌患者预后不佳。

虽然人源化单抗Herc印tin的问世，为部分乳腺癌的治疗提供了新的方向[6]。但目前，相关抑癌机理尚不能统一，其中最主要的2种为：①Herc印tin造成抗体介导细胞毒反应；②单抗Herc印tin可以通过降低HER.2受体的磷酸化水平，下调HER.2的表达，从而使HER.2受体减少，进而减少了对下游信号通路激活达到抑抑制癌症作用[7]。

本次研究结果显示：ImL可抑制来源各不相同的乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7、、SK-B-3)、HUVEC (人脐静脉内皮细胞)、卵巢癌SK-OV-3细胞系增殖。RHL在针对不同的卵巢癌、乳腺癌细胞系，有同等的癌症抑制作用。此外，在HUVEC增殖的抑制作用方面，RHL比肿瘤细胞弱。本次研究实验中，在抑制肿瘤细胞增殖的作用方面，对RH、以DMSO做为溶剂的大黄酸两者的比较结果显示：RHL与大黄酸有相近的肿瘤细胞增殖抑制作用。

参考文献

[1]Dieras V，Vincent-Salomon A，Degeorges A，et al.Trastuzumab(Herceptin)and breast cancer：mechanisms of resistance 〔J〕.Bull Cancer，2007，94(3):259-266.

[2]Cho HS，Mason K，Ramyar KX，et al.Structure of the extracellular region of HER-2 alone and in complex with the Herceptin Fab〔J〕.Nature，2003，421(6924)：756-760.

[3]Li J，Chen YN，Duan JC，et al.Effects of ErbB signal and p-

rotein kinase B on monkey cardiocyte apoptosis induced by rapid pacing〔J〕.Yao Xue Xue Bao,2007,42(5):470-474.

[4]Joshi M,Pakhomov S,Pedersen T,et al.A comparative study

of supervised learning as applied to acronym expansion in clinical reports〔J〕.AMIA Annu Symp Proc，2006:399-403.

[5]Painovich J,Herman PM.Acupuncture in the inpatient acute care setting:a pragmatic,randomized control trial〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2012,2012:309762.

[6]Sale mMA.Advances in vascular cognitive impairmen idiabetesmellitus〔J〕.Pediatr Diabetes，2012,3(1):37-41.

[7]Stier W.Middle cerebral artery occlusion products involvem-

ent of N-methyl-D-aspartate receptor〔J〕.J Sport Manage，2011,2(1)：60-97.

(编辑：吴小红)

Effect of Rhein on the Expression of HER-2 Protein in Breast Tumor Cells

LINJingguan.TheAffiliatedCancerHospitalofXiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha,410008

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of rhein on the expression of HER-2 protein in breast cancer cells.MethodsImmunocytochemistry was used to detect change of EGFR and HER-2 protein expression level.MTT was used to detect the cells proliferation,different phosphorylation levels,level of the expression of receptor PT pathway protein.RT-PCR was used to detect change of HER-2 protein expression in the gene transcription level.FACS was used to detect cell cycle and apoptosis.Results1 mL can inhibit breast tumor cells lines of different origins (MDA,MB-231,MCF-7,SK-B-3 ),human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) proliferation,ovarian cancer cell line SK-OV-3,IC50 was 95 μmol/L,200 ml and 85 μmol/L,80 ml and 110 μmol/L,300 ml.And RHL was similar to rhein in inhibiting the proliferation of tumor cells.Study of mechanism of RHL anti-tumor,high expression of EGFR and HER-2 in SK-Bf-3 cells,which can inhibit EGFR and HER 2 protein expression and phosphorylation level,and can induce tumor cells through p53 and p21 pathways of apoptosis.High expression of EGFR and low expression of HER-2 in MCF-7 cells,inhibited the phosphorylation of EGFR and downstream Raf/MEK/ERK pathway,and with other chemotherapy drugs paclitaxel played a synergistic antitumor effect.ConclusionRHL can inhibit EGFR and HER-2 dual target model,cell proliferation and induction of apoptosis.

【Key words】Rhein;Breast cancer;HER-2 protein;Tumor cell;Influence

(收稿日期2014-10-08修回日期 2015-03-25)

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)05-0639-02

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.05.003