巧克力中乳脂肪的鉴别及含量测定

李 蕊 徐小明

（1.浙江省血液中心检测中心 浙江 杭州 310052；2.浙江省疾病预防控制中心理化检验所 浙江 杭州 310051）

1 引言

由于技术和经济等方面的原因，很多巧克力产品中部分可可脂被其他物质取代［1］，如乳脂肪、代可可脂、类可可脂等。我国于2004年7月起正式执行的《巧克力及巧克力制品》国家标准中明确规定巧克力中非可可植物脂肪的添加量不得超过5%［2］，但该标准缺乏具体的检测方法，只能根据厂家提供的原始配料进行估算。因此要通过检测巧克力中脂肪酸特点来达到测定非可可植物脂肪的目的，首先应排除乳脂肪对检测结果的干扰。

对此，国内外学者进行了大量的研究，主要集中在对巧克力中甘油三酯和脂肪酸的检测两个研究方向。ISO 23275－1和ISO 23275－2［3］中公布了通过检测甘油三酯来对黑巧克力中掺入的类可可脂含量进行检测的方法，但由于乳脂肪中的甘油三酯会对类可可脂的定量测定起到干扰作用，因此这种方法不适用于牛奶巧克力的检测。也有学者通过测定乳脂肪中的丁酸及其与肉豆蔻酸、棕榈酸的比率来测定乳脂肪的含量［5］，但由于丁酸具有不稳定性，会随时间和环境的变化发生量的变化，因而可能造成定量不准确。本研究通过测定乳脂肪中的脂肪酸发现C14：1仅在乳脂肪中存在，且在各种乳脂肪中含量稳定，是很好的鉴别标准物。同时本方法通过较为简便的计算方法即可达到准确定量的目的，不失为一种检测巧克力中乳脂肪含量的可行方法，并为进一步测定巧克力中非可可植物脂肪的含量奠定了基础。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料：仪器与试剂Agilent 6890N 气相色谱仪，7683自动进样器，HP ChemStation 化学工作站（美国安捷伦公司）；分析天平AL104－IC（梅特勒－托利多仪器有限公司）；旋涡混合器WH－861（太仓市华利达实验设备有限公司）；旋转蒸发仪Laborota 4003Control（德国Heidolph 公司）；电热恒温干燥箱ED－53（德国Bindent GmbH 公司）；微量移液器（瑞士SOCOREX 公司）。试剂：甲醇、乙醇、正己烷、无水乙醚、，均为色谱纯，氢氧化钾、氯化钠均为分析纯，氨水、2mol／L 盐酸甲醇溶液。

2.2 标准品的配置：量取1ml 10.0mg／ml的37种脂肪酸甲酯混合标准品，用正己烷定容于10ml棕色容量瓶中，配制成质量浓度为1000 mg／L的标准储备液，于－20℃下保存。取各标准储备液适量，用正己烷稀释配制所需浓度的混合标准工作液，密封，于4 ℃下保存备用。

2.3 实验方法

2.3.1 色谱条件：选用CP－Sil 88FAME 毛细管石英柱（100in×0.25Inm×0.20m），FID 检测器，载气为高纯氮气，柱温60℃保持2min后以15℃／min升温到100℃，再以4℃／min升温到230℃保持15分钟；进样口温度为250℃，检测器温度280℃，分流比1：5；载气流量1.5ml／min。

2.3.2 脂肪酸提取方法：准确量取液体试样10ml，加入2ml氨水，置于65℃水浴15min，取出轻摇，冷至室温，在制备好的样品中加入10 ml乙醇，混匀。加入12.5ml无水乙醚，加塞振摇1min。在加入12.5ml正己烷，加塞振摇1min，静置、分层，有机相转入磨口平底烧瓶中，重复操作两次。合并抽提液于磨口平底烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至干。

2.3.3 脂肪酸的甲酯化：准确称取10mg（精确至0.1mg）提取样品，加入0.7ml 1mol／L的KOH／CH3OH 溶液，混匀，置于60℃水浴中振荡3min，待冷却至室温，加入1ml 2mol／L 的HCl／CH3OH 溶液，混匀，置于50℃烘箱中反应15min后，待冷却至室温，加入3ml饱和NaCl溶液，1ml正己烷，混匀，离心，取上清液待测。

3 结果与讨论

3.1 巧克力中乳脂肪的定性鉴别：通过对乳脂肪、可可脂、类可可脂、月桂酸型代可可脂、非月桂酸型代可可脂及各种植物油的脂肪酸进行检测，发现C14：1只存在于乳脂肪中，见图1，且C14：1／C12：0的范围在0.2～0.3之间，通过对其中各种脂肪酸含量特点的分析发现，两种代可可脂中C14：1和C12：0 的含量与乳脂肪和可可脂相差较大，因此根据C14：1／C12：0的范围较容易将加入了代可可脂的牛奶巧克力鉴别开来，而类可可脂中C14：1和C12：0的含量与可可脂极为相似，因此还不能鉴别牛奶巧克力中加入了类可可脂的情况。见表1。

表1 油脂中C12：0及C14：1的含量及其比值

图1 纯可可脂、乳脂肪、月桂酸型代可可脂、类可可脂叠加色谱图

3.2 乳脂肪的定量检测：通过按5%、10%、15%、20%和30%的比例向纯可可脂中掺入乳脂肪，得到各种脂肪酸的线性方程，根据表2中的数据对定量方程进行筛选。首先，从表2中的数据可以看出，同一种脂肪酸的含量在不同乳脂肪和可可脂中存在一定的差异，为了削弱这种差异而达到准确定量的目的，需选择相对标准差较小的指标，因此将C14：0这一指标排除。其次，在相对标准差满足条件的同时应考虑选择线性相关性好的指标，据此将C16：0 这一指标排除。最终确定C14：1、C16：1 和C18：0这三个指标为计算巧克力中乳脂肪含量的指标，可以通过这一系列线性方程分别求出加入的乳脂肪的量，再求其平均值作为乳脂肪的加入量。同时我们也对这三个定量方程的准确性做了进一步的验证，见表3。用其对三个不同的模拟组进行计算，结果的相对误差在0.5%～26%之间，能够满足检测的要求。

表2 乳脂肪和可可脂中五种脂肪酸成分的相对标准偏差及线性回归方程

表3 模拟掺伪巧克力中乳脂肪测量值与真值比较

从定性的结果来看我们不能将加入了类可可脂的牛奶巧克力鉴别开来，因此我们对加入类可可脂的情况也进行了模拟，向含有一定量乳脂肪的可可脂中分别加入5%和10%的类可可脂，见表3。根据检测结果可以看出，在加入类可可脂的情况下，运用上述三个指标对其中加入乳脂肪的量进行计算，结果也是可以满足检测要求的。这样就实现了对非代可可脂巧克力中乳脂肪含量的准确检测。

当C14：1／C12：0的比值超出0.2～0.3这个范围时，说明巧克力中有代可可脂的加入，此时对乳脂肪含量的检测只能用C14：1的定量方程对其进行计算。

4 小结

虽然饲料、地域、季节等因素会使牛奶中乳脂肪的某些成分存在一定的差异，但仍有一部分脂肪酸所占的百分含量比较稳定，本研究较好的利用了这一特征，成功的建立了一种检测巧克力中乳脂肪含量的气相色谱方法。并且本方法具有易于操作、计算方法简单等优点，为进一步检测巧克力中非可可植物油的含量打下了良好的基础。

［1］ Lippm，Anklame.Review of cocoa butter and alternative fats for use in chocolate－part A.Compositional data.Food Chemistry，1998，62（1）：73－97

［2］ GB－T 19343－2003 巧克力及巧克力制品［S］.

［3］ ISO 23275－1.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 1：Determination of the presence of cocoa butter equivalents.2006

［4］ ISO 23275－2.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 2：Quantification of cocoa butter equivalents.2006

［5］ MUUSE B，MARTENS R.Mixtures of milk fat with non－milk fat－Determination of the milk fat content［J］.Int.Dairy Fed.Bull.1993，285：65－69