柠檬酸钙复合材料促进骨腱愈合的实验研究

安 涛，陈庆玉，李 苏，周英勇，赵志蓉，彭 磊

骨腱损伤为临床常见运动损伤性疾病，前交叉韧带(ACL)、肩袖、跟腱及髌韧带等与骨接触点损伤最为常见。目前对骨腱损伤行重建手术治疗已成为临床共识，但术后骨腱结合点常不牢固、断裂，致重建手术失败，研究示肩袖损伤术后失败率为20%～94%［1］，前交叉韧带为10%～25%［2］。研究表明术后早期骨腱结合处为移植物-骨隧道复合体的薄弱环节［3］，因此，肌腱与骨附着部位早期愈合的质量为肌腱移植重建术成败的关键。

目前，促进骨腱愈合研究众多，含生长因子介质填充［4］、重组骨形态发生蛋白(BMP-2)填充等，羟基磷灰石、磷酸三钙［5］等骨移植材料促进骨腱愈合短期效果尚可，但吸收困难、降解性差，疗效不明确。本研究采用可注射型海藻酸钠-明胶-柠檬酸钙复合材料，同时经过反复实验得出各成分最佳比例，并在合适动物实验模型中将复合材料注入骨腱间隙中，研究此种材料对骨腱愈合的作用，为临床治疗骨腱损伤提供新方法。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 健康成年雄性日本大耳白兔48只，体重3．0～3．5kg，平均(3．3±0．2)kg，温州医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 海藻酸钠干粉(美国Sigma公司)，明胶干粉(河北绿岛公司)，柠檬酸钙(天津市登峰化学试剂厂)，电钻(BOSCH电钻，德国罗伯特博世有限公司)，钻头(上海医疗器械公司)，电子天平(LIBRORAEG-XT220A型，美国)、离心机(京立，LD5-2A，北京)，全自动组织切片机(LEICA RM2145，德国)、深低温冰箱(MDF-382E型，SANYO公司)、超净工作台(CA-920-3，上海上净净化设备有限公司)、光学显微镜(Olympus，日本)，万能材料力学实验机(Zwick/Roell BTC-FR020TN．A50，德国)，显微镜及其摄像机(OLYMPUS B×40显微镜，JVC TK-C1381摄像机)。

2 实验方法

2.1 可注射型柠檬酸钙复合材料的制备 根据文献［6］及前期实验结果，称取明胶1．5g放入20mL生理盐水中，高压灭菌消毒。海藻酸钠1．0g，高压灭菌消毒后备用。无菌间内，在超净台内用生理盐水25mL溶解海藻酸钠1．0g。再将明胶液与海藻酸钠溶液混匀，得到海藻酸钠与明胶质量比为2∶3的胶状液体，静置后，低速离心，使小气泡消失。超净台内抽取上述混合液4mL，加入柠檬酸钙粉末3．0g(最佳质量比，海藻酸钠∶明胶∶柠檬酸钙=2∶3∶70)，得到凝固性能最佳，又可良好注入的复合材料。使用时在注射器内搅拌均匀混合成糊状，在5min内使用完毕。

2.2 实验动物模型的建立 腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3．5mL/kg)，生效后双后肢备皮，仰卧位将动物固定手术台上，常规消毒铺无菌巾单。采用Nakase动物实验模型［7］(图1a)。在髌韧带外侧约1cm位置上下各延长约1cm，仔细钝性分离软组织，暴露趾长伸肌腱，向上、下钝性分离，在其止点-股骨外侧髁将其切断，游离的肌腱末端采用4-0缝线行编织缝合(图1b)。然后将胫前肌筋膜切开，将胫前肌向两侧分离，在胫骨干骺端近端垂直于胫骨长轴用电钻钻取直径约2．5mm的孔洞，已经缝合好的肌腱游离末端穿过骨隧道，在胫骨皮质骨嵴垂直胫骨长轴钻取直径为约0．2mm的孔洞，穿过Prolene缝线末端，缠绕固定(取材时已证明固定效果良好)(图1c、d)。将上述制备的可注射型海藻酸钠-明胶-柠檬酸钙采用5mL注射器及19号针头注入右侧骨腱隧道中(以实验动物右侧肢为实验侧，左侧为对照侧)，对照侧注射相同剂量的海藻酸钠-明胶共混体。再次聚维酮碘溶液消毒，肌注160万U青霉素预防感染，并予以宽松无菌敷料包扎。术后1周内每天手术刀口聚维酮碘涂抹消毒，肌注80万U青霉素。

图1 实验动物模型建立。a．趾长伸肌腱动物模型;b．游离的肌腱末端Prolene编织缝合;c．采用克氏针行骨隧道造模;d．Prolene线末端胫骨嵴悬吊固定

2.3 标本的获取及检查

分别于术后2、4、6、8、10、12周空气栓塞处死各组动物8只后立即进行取材，取4只骨腱标本，剔除较长的肌腱、周围肌肉、韧带筋膜及其他附着物，沿骨腱界面纵轴切开，在10%中性甲醛溶液固定，用10%的甲酸溶液脱钙、石蜡包埋，沿骨腱界面纵轴面切片，厚度4μm，行HE染色。采用上述方法进行HE染色后，每组随机取2张切片，光镜下每张切片取3个视野(×200)，用Image-Pro Plus 8．0图像分析软件观察测量各时间点各组标本中移植肌腱周围每1mm2的新生骨绝对面积。

其余4只保留较长肌腱，游离的趾长伸肌腱末端与胫骨干骺端分别固定于万能材料实验机上，测试前将固定于末端趾长伸肌腱与胫骨前端骨嵴的缝线线结切除，保留胫骨干骺端内侧端的固定，以使负荷作用于骨腱界面，使胫骨干骺端骨腱界面组织成为唯一测试的力，期望断裂点位于胫骨干骺端骨隧道内或是骨腱隧道开口处，行最大拉脱负荷实验(maximum pull-out test)，按5mm/min速度加载负荷，最大加载负荷为500N，测试时保持室温(20±2)℃，湿度65%，测试骨腱界面的抗拉脱强度，通过Zwick/Roell软件描记位移-负荷曲线。观察趾长伸肌腱的断裂部位或者是否从骨隧道内拉出，记录断裂负荷或拉脱负荷，此时的力为最大负荷。

3 统计学方法

对实验数据采用SPSS 18．0软件进行统计学处理，配对t检验及独立样本t检验进行统计学分析。以P＜0．05为统计学上差异有显著性意义，P＜0．01表示差异显著。

结 果

1 组织学观察

柠檬酸钙组2周在柠檬酸钙复合材料周围出现大量成骨细胞;4周时有骨岛出现，骨腱间出现大量Sharpey纤维，骨腱间连接紧密且出现大量软骨细胞;6周时骨腱间出现更为密集且排列有序的Sharpey纤维，并且在骨腱结合处夹杂大量成骨细胞和部分软骨细胞;8周时骨腱间Sharpey纤维集结成束，界面间可见更多的新生骨，组织中含有大量成骨细胞，移植肌腱与新生骨紧密结合形成纤维软骨连接;10周时骨腱结合处大量的新生骨形成，其间绝大部分可见连续性纤维软骨连接，成纤维细胞明显减少，并有少量钙化软骨形成;12周出现大量的钙化软骨，结合处几乎全部有新骨生成及纤维软骨形成，形成直接连接，出现潮线，类似正常的骨腱止点。

而对照侧4周时仅出现少量Sharpey纤维，10周时出现的Sharpey纤维排列才较为密集，12周时骨腱间才仅见少量新骨生成，骨腱间才可见少部分肌腱与周围骨组织呈纤维软骨连接(图2)。

图2 各组各时间点组织学观察结果。a．4周对照组(HE ×100);b．4周实验组(HE ×100);c．10周对照组(HE ×100);d．10周对照组(HE ×100);e．12周对照组(HE ×100);f．12周对照组(HE ×100);g．4周实验组骨腱间可见大量软量细胞增生

2 成骨面积分析

从表1可以看出，肌腱周围新生骨面积在柠檬酸钙实验组明显比对照组多，在各个时间节点具有差异性，并且这种差异性随着时间的延长逐渐减少，这说明柠檬酸钙对新生骨形成具有促进作用，这种促进作用在早期较为明显。

3 生物力学实验测试

在6周内无论实验侧还是对照侧，拉出部位均在胫骨干骺端隧道内;其余时间点断裂部位或拉出部位在各组不完全相同(表2)。实验侧和对照侧在各时间节点生物力学检查其抗拉脱强度不同，实验侧在2、4、6周时间节点与对照侧相比具有更大的抗拉脱强度(P＜0．01)，8周以后伴有少部分为韧带实质部断裂而非拉脱(pull-out)。以上表明，柠檬酸钙对骨腱愈合具有促进作用，能增加骨腱的抗拉脱强度，但柠檬酸钙对骨腱抗拉脱的贡献主要在早期(表3)。

表1 移植肌腱新生骨面积(mm2)

表2 柠檬酸钙组重建韧带拉脱或断裂部位

表3 生物力学实验强度(N)

讨 论

笔者课题组前期已证实柠檬酸钙为一种优良的骨生物材料［8-11］:(1)对成骨细胞有正性作用:明显促进成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖、分化;(2)良好骨传导活性:促进兔股骨原位骨缺损良好修复;(3)良好降解性:小鼠肌袋实验中，6周全部降解，明显促进肌肉内骨形态发生蛋白(BMP)所致异位成骨;(4)促进异位成骨性:大量促进大鼠跟腱切断术所致异位成骨，新生骨长入跟腱中，骨腱结合紧密，出现大量软骨细胞。据此，笔者推断柠檬酸钙极有可能成为良好的天然骨腱修复材料促进剂。柠檬酸钙粉末较难填充于骨腱隧道中，且易导致分布不均，局部浓度过高导致毒性。海藻酸钠分子链上含有大量的羟基和羧基，在Ca2+等二价离子存在的条件下，可形成交联的海藻酸钠钙聚合物，表现为凝胶状态［12］，具有很好的机械强度，便于成形。明胶具有亲水性强、成膜性好、侧链基团反应活性高、典型的两性电解质特征等诸多优良的物理与化学性质，能溶于热水，冷却后冻成凝胶状物。因此，本研究拟采用海藻酸钠与明胶作为可注射复合材料的固形剂。

韧带或者腱的止点根据其结构不同可以分为直接止点(纤维软骨止点)和间接止点(纤维止点)。直接止点多位于干骺端，有纤维组织、纤维软骨、钙化软骨、骨组织典型的四层结构，纤维软骨和钙化软骨之间有嗜碱性染色的潮线［13］。正常骨腱止点为典型末端结构，即为上述的直接止点，这类止点存在平行的胶原纤维和纤维软骨，其线性垂直的结构可以有效传递拉力。因此，在骨腱重建术后，移植肌腱在骨髓道内最理想的愈合方式应与正常的骨腱止点类似。在本实验中，对照侧4周时仅出现少量Sharpey纤维，10周时出现的Sharpey纤维排列才较为密集，12周时骨腱间才仅见少量新骨生成，骨腱间可见少部分肌腱与周围骨组织呈纤维软骨连接。实验组骨腱间4周时有骨岛出现，骨出现大量Sharpey纤维和大量软骨细胞;8周时移植肌腱与新生骨紧密结合形成纤维软骨连接;10周时骨腱绝大部分可见连续性纤维软骨连接，并有少量钙化软骨形成;12周出现呈钙化软骨，结合处几乎全部有新骨生成及纤维软骨形成，形成直接连接，出现潮线，类似正常的骨腱止点。实验组Sharpey纤维、纤维软骨、钙化软骨出现明显早于对照侧，且骨腱间间隙实验组比同期对照组明显减小，说明可注射型海藻酸钠-明胶-柠檬酸钙对骨腱愈合具有明显的促进作用，对骨腱间的愈合更易形成直接连接，使其更接近正常状态下骨腱结合部位的组织学结构特点。

研究表明:5mmol/L的Ca2+浓度为最佳钙离子成骨浓度［14］，而柠檬酸钙释放的Ca2+浓度为5．1mmol/L，理论上符合最佳成骨浓度要求，可有效促进成骨。Ca2+也可刺激分泌类胰岛素样生长因子(IGF-1/2)等促分裂因子，促进胶原矿化，促进成骨细胞及肌腱细胞生长［15-16］。Ca2+促进分泌的BMP可促进、诱导骨生成及纤维结缔组织增生，使骨组织向肌腱内长入形成直接愈合，同时BMP在肌腱内可诱导成骨，加速损伤肌腱愈合［17］。骨腱愈合过程比较复杂，基本过程是骨腱愈合界面纤维组织形成连接，新骨形成，骨向肌腱内长入，局部塑型改造。柠檬酸钙组肌腱周围新生骨面积明显比对照组多，在各个时间节点具有差异性，这说明柠檬酸钙对新生骨形成具有促进作用。生物力学实验提示术后6周内，实验侧骨腱愈合抗牵拉强度明显高于对照侧，能增加骨腱的抗拉脱强度，说明柠檬酸钙对骨腱愈合具有促进作用。因此可以推断，可注射型柠檬酸钙对骨腱愈合的促进作用可能通过促进新生骨形成，新生骨进而长入移植肌腱组织，从而增强骨腱愈合的强度。

本实验动物模型为关节外动物模型，没有打开关节腔，与国内外广泛采用的ACL重建术动物模型不同，无关节液、滑液等的影响，毕竟关节内与关节外的生理环境具有较大的差异，柠檬酸钙凝胶在关节内动物模型中是否具有同样作用，需进一步研究。

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