非标记脱氧核酶构象改变荧光法检测铀酰离子

曹金秀，王永生

(南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

铀是重要的国防和能源物质，它的日益增长的开发和利用给人类带来了福音;同时，也增加了人们暴露这种有毒有害物质的风险［1-2］。所以，对环境中铀污染物进行有效监测是极其重要的。现行检测铀酰离子的技术有电化学分析法［3］、光谱分析法［4］、质谱分析法［5］和放射线检测法［6］等。虽然各有优点，但考虑到环境样品组分复杂、含量低以及昂贵仪器不宜推广等因素，本文建立了一种简便、高特异性和高灵敏度的新方法。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

酶 链:5 ’-TCTCTTCAGTTCGGAAACGAACCTTCAGACATAGTGAGTC-3’、底物链:5’-CCCCAGTCACTCACTATrAGGAAGAGAT-3’、UO2(CH3CO2)2·2H2O 、MES、SYBR GreenⅠ、焦炭酸二乙酯均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。所有试剂和水均用1‰焦炭酸二乙酯处理。

F-4500 荧光分光光度计;AB204-S 电子分析天平;PB-21 型精密酸度计。

1.2 溶液制备

1.2.1 铀标准储备液 准确称取UO2(CH3CO2)2·2H2O 标准品0.021 4 g，灭菌超纯水溶解并定容至50.0 mL 容量瓶中，即得铀储备溶液浓度为10－3mol/L。

1.2.2 铀标准工作液 临用前用灭菌超纯水将铀标准储备液逐级稀释至10－7mol/L。

1.2.3 MES 缓冲溶液(pH 5.5，500 mmol/L) 准确称取11.560 0 g MES，定容至100 mL 容量瓶，调节pH 为5.5 存储备用。

1.2.4 SYBR Green Ⅰ(5 ×) 用10 000 ×SYBR Green Ⅰ逐级稀释得到，备用。

1.3 实验方法

在2 mL 的EP 管中，依次加入7 μL(5 μmol/L)底物链，5 μL(5 μmol/L)酶链，10 μL MES 缓冲溶液(pH 5.5)，于95 ℃水浴5 min，室温放置1 h。在制备的核酸酶(DNAzyme)中加入不同体积的铀标准溶液，室温反应40 min，然后加入50 μL SG 溶液(5 ×)，混匀并加水补齐至450 μL，室温孵育15 min后，置于石英比色皿，于荧光分光光度计进行荧光光谱扫描。光谱测定条件:狭缝宽度均为5 nm，激发波长为497 nm，发射波长为524 nm。

2 结果与讨论

2.1 光谱特性

图1 DNAzyme-SG-UO22+体系的荧光光谱图Fig.1 Fluorescence spectra of DNAzyme-SG-UO22+ system c UO22+(×10 －8 mol/L)/(1 ～6):0，0.5，1.1，2.7，3.3，4.4

由图1 可知，DNAzyme-SG 复合物的荧光强度很强(曲线1)，当加入不同浓度的之后，体系的荧光强度逐渐减弱(曲线2 ～6)，且浓度与荧光强度呈良好的线性关系。据此，建立了非标记荧光法检测的新方法。

2.2 实验条件优化

2.2.1 MES 缓冲液的pH 值及用量优化 用MES缓冲溶液，研究了pH 4.0 ～6.5 范围内对体系荧光强度的影响见图2。

图2 pH 对体系荧光的影响Fig.2 Effect of pH on the fluorescence

由图2 可知，pH 由4.0 ～5.5 时，体系的荧光变化值逐渐增加，当pH 为5.5 时，体系的荧光变化值最大。随后，pH 继续增加，荧光变化值反而减小，这可能是铀酰离子与其特异性的DNAzyme 作用对pH有严格要求。进一步进行用量优化，实验表明，加入10 μL MES 能得到较好的ΔF。因此，本实验选择10 μL、pH 5.5 的MES 缓冲溶液控制溶液酸度。

2.2.2 SG 用量优化 本体系的检测信号是由SG染料提供，进行用量优化时在5 ～150 μL 范围内。随着SG 用量增加，F 值增加，在加入量为50 μL 时开始出现平台，说明体系核酸链嵌入染料已经饱和，因此，本实验选用50 μL SG。

图3 SG 用量对体系荧光的影响Fig.3 Effect of SG on the fluorescence

2.2.3 铀酰离子作用时间优化 体系的ΔF 随着铀酰离子作用时间增加而增强，当达到40 min 时出现平台期，故实验选有40 min 为作用时间。

2.2.4 核酸链比例优化 为了保证核酸链充分形成双链，以及对实验成本的考虑，对底物链和酶链比例进行了优化，底物链与酶链的摩尔比达到7∶5，体系得到较好的ΔF。

2.3 测定方法的选择性

在优化的最佳实验条件下，实验了可能共存的多种离子和物质对体系的影响，当相对标准偏差≤± 5% 时，500 倍Ca2+;200 倍Mg2+;100 倍 的H2PO4－、PO43－、K+、HPO42－、Cu2+、Sr2+、Zn2+、Al3+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Cr3+、Tb3+、Cl－、CO22－、SO42－、Hg2+;50 倍Pb2+均不干扰测定，说明该方法选择性良好。

2.4 测定方法的检测范围、检出限和精密度

在优化出的最佳实验条件下，铀酰离子浓度范围为1.73 ×10－9～4.40 ×10－8mol/L 时，体系的荧光变化值呈现较好的线性关系，线性回归方程为ΔF=108.99C(×10－8mol/L)+79.22，相关系数r =0.990。根据空白管的标准偏差Sb和标准曲线的斜率k 算出LOD 为5.2 ×10－10mol/L。平行测定11次浓 度 为1.11 × 10－8，2.22 × 10－8，3.33 ×10－8mol/L的铀酰离子，RSD 依次为2.16%，1.50%和3.10%。

2.5 样品测定

采集一份铀矿石浸润液和一份铀矿山地表径流水，将水样混匀后滤纸过滤，然后再用0.22 μm 针头式过滤器二次过滤除去杂质。随后用pH =5.5 MES 缓冲溶液调节体系的pH，加入量为每5 mL 水样中加入0.5 mL MES 缓冲溶液。样品中铀酰离子浓度较大，分别稀释2 000 倍和1 000 倍，储存备用;将2 个实际样品进行测定并做加标回收实验，结果见表1。

表1 样品中UO22+检测结果(n=6)Table 1 Determination results of UO22+ in the samples

3 结论

铀酰离子特异性识别铀脱氧核酶，使之在rA 碱基处断裂，释放出单链，导致SG 从双链DNA 中游离出来，荧光信号发生改变，据此建立了环境水样中痕量铀的检测新方法。新建方法简便、实用、灵敏度和选择性高，已用于实际样品中的测定，结果满意。

［1］ 商照荣.贫化铀的环境污染影响及其对人体健康的危害［J］.辐射防护，2005，25(1):56-61.

［2］ Villa M，Manjon G，Hurtado S，et al.Uranium pollution in an estuary affected by pyrite acid mine drainage and releases of naturally occurring radioactive materials［J］.Marine Pollution Bulletin，2011，62(7):1521-1529.

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［6］ Landsberger S，Kapsimalis R.Comparison of neutron activation analysis techniques for the determination of uranium concentrations in geological and environmental materials［J］.Journal of Environmental Radioactivity，2013，117:41-44.