浊点萃取法在脱脂月见草子中抗氧化成分提取中的应用

刘学，邱香，曹光群，姜晓燕

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

月见草(Oenothera biennis L.)又名夜来香、山芝麻等，为柳叶菜科月见草属一年生或二年生草本植物［1］。月见草种子含脂肪油20% ～28%，月见草油被誉为“世纪的功能性食品的主角”，受到医药、食品保健、美容健肤等领域的广泛重视［2］。

近年来，从月见草属植物中分离出脂质、类黄酮、单宁酸、类固醇、三萜烯等化学成分，另外其中还含多酚、生物碱、氨基酸、皂苷等成分［3-5］。据文献报道，油性成分被提取后的月见草子残渣中含有强抗氧化性物质，具有很好的开发利用价值［6］。

浊点萃取法(CPE)是一种以表面活性剂的水溶液代替有机溶剂作为萃取剂的新型液-液萃取技术，它利用表面活性剂的增溶和浊点现象而实现高效提取［7］。目前，CPE 已较多的应用于金属离子、多环芳烃、大分子类物质的富集和分析领域，在天然植物活性成分提取方面的研究相对较少［8-9］。CPE 操作步骤简单、应用范围广、不使用有机溶剂、表面活性剂可回收、活性成分在提取过程中不易变性，且具有易于放大、对环境友好的特点［10-11］。在提取过程中，如果选择水为主要提取溶剂，同时利用CPE 的这些特性，将有利于开发更具生物活性的产品以及进一步的工业化应用。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

月见草子，河北安国市百味堂药店;Triton X-110、1，1-二苯-2-苦基肼(DPPH)为阿拉丁试剂;脂肪酸聚醚酯PGPL、EO8 均为自制;氯化钠、无水乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)均为分析纯;实验用水为蒸馏水。

TG1650-WS 离心机;KH-100B 超声波清洗仪;YLJYE-100 数显式电热恒温水浴锅;TU-1901 双光束紫外可见分光光度计;DFY-300 摇摆式高速万能粉碎机;FA1604 上皿电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 样品脱脂 将月见草子用粉碎机粉碎，过40 目标准筛，置于锥形瓶中，加入15 倍量(V/m)的石油醚，超声提取30 min，常压过滤。在滤渣中再加入15 倍量的石油醚，重复提取1 次。滤渣40 ℃干燥12 h，得脱脂月见草子粉末。

1.2.2 CPE 提取 准确称取脱脂月见草子粉末1.0 g于50 mL 锥形瓶中，加入表面活性剂溶液，混合均匀，超声提取2 次，每次30 min。提取溶液以8 000 r/min转速离心30 min。将上清液小心转移至干净的容器中，合并2 次上清液，加入适量NaCl，再次混合均匀，置于50 ℃水浴中恒温保持一定时间。继以6 000 r/min 的转速离心10 min，溶液清晰分为两层:下层为水相，上层为表面活性剂富集相。去除水相，表面活性剂富集相中加入15 mL 无水乙醇，充分振荡摇匀后以6 000 r/min 的转速离心5 min，将上清液转移至25 mL 容量瓶中，定容，待测。

1.3 抗氧化活性

1.3.1 清除DPPH 自由基(DPPH·)的反应动力学曲线测定 在10 mL 离心管中依次加入1.0 mL待测样品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，立刻混匀，倒入比色皿中。以1.0 mL 待测样品溶液和3.0 mL 无水乙醇为参比，在517 nm 处测吸光值随时间的变化曲线，确定最佳反应时间。

1.3.2 DPPH·清除率测定 (1)在10 mL 离心管中 依 次 加 入 1.0 mL 无 水 乙 醇 和 3.0 mL 0.125 mmol/L的DPPH 溶液，遮光混匀，待反应稳定后，以无水乙醇为参比，在517 nm 处测吸光值，记为A0。

(2)在10 mL 离心管中依次加入1.0 mL 待测样品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，遮光混匀，待反应稳定后，以无水乙醇为参比，在517 nm 处测吸光值，记为A1。

(3)在10 mL 离心管中依次加入1.0 mL 待测样品溶液和3.0 mL 无水乙醇，遮光混匀，待反应稳定后，以无水乙醇为参比，在517 nm 处测吸光值，记为A2。

自由基清除率(X)，按下式计算:

2 结果与讨论

2.1 CPE 提取物清除DPPH·反应动力学

为了解DPPH 反应体系在加入样品溶液之后的吸光值随时间的变化规律，可用高浓度和低浓度样品溶液反应体系进行测定。高浓度体系是指提取物质量浓度在10 ～100 mg/mL，此时清除率均在95%～98%之间波动;低浓度体系是浓度在0.33 ～2 mg/mL，此时清除率随浓度的增大而升高，呈正向相关性。因此在低浓度范围内选定一个浓度，比较该样品浓度下的DPPH·清除率的不同，从而可以以提取物的清除DPPH·能力为指标来判断萃取能力的高低。动力学曲线反映了CPE 提取物中活性成分与DPPH·反应随时间的变化趋势，通过动力学曲线可找出反应达到平衡时所需的时间，结果见图1。

图1 CPE 提取物溶液清除DPPH·动力学曲线Fig.1 Kinetic curve of DPPH· scavenging by CPE extract

由图1 可知，在CPE 提取物溶液作用下，反应体系的吸光度在最初的20 min 内下降较快;20 ～50 min变化趋于平缓;60 min 后吸光度相对稳定，故选择反应时间为60 min。

2.2 表面活性剂选择

PGPL 和EO8 分别为在本实验室以月桂酸和不同比例的环氧丙烷和环氧乙烷反应所得脂肪酸聚氧乙烯酯，具有较低的浊点。以PGPL、EO8 和Triton X-100 三种表面活性剂溶液(40 g/L)进行CPE 提取，各表面活性剂溶液以及所得到提取物的DPPH·清除率的结果见表1。

表1 不同表面活性剂和CPE 提取物的DPPH·清除率Table 1 DPPH· scavenging rates of different surfactants and extracts

由表1 可知，表面活性剂PGPL、EO8 和Triton X-100 清除DPPH·能力极弱，不会对样品清除DPPH·能力产生干扰。同样萃取条件下，Triton X-100表面活性剂的DPPH·清除率最高。因此，以下实验中均选用Triton X-100 作表面活性剂，同时，Triton X-100 作为浊点萃取剂具有浊点温度低，密度较高，有利于离心分离，价格低廉等优点。

2.3 提取工艺的优化

2.3.1 单因素实验 各单因素实验条件下所得提取物的DPPH·清除率见图2。

由图2A 可知，随着平衡时间增长，DPPH·清除率随之上升，但超过30 min，DPPH·清除率略微下降。这可能是由于当平衡时间过长，会导致浊点萃取向反方向变化，表面活性剂相逐渐消失。故平衡时间30 min 较佳。

由图2B 可知，随着液固比的增大，DPPH·清除能力增强，固液比超过30 ∶1 mL/g 后，DPPH·清除率基本稳定。这有可能是因为样品中的活性物质的量一定，或者受表面活性剂的官能团的种类和数量的限制，再继续增加萃取液的量，DPPH·的清除率也不会再上升。所以液固比为30 ∶1 较佳。

本实验选用氯化钠作为电解质，因其阳离子Na+无盐溶效应，故阴离子盐析效应使浊点降低。由图2C 可知，随着离子强度的增大，DPPH·的清除率也变大。这是由于对像Triton X-100 这一类的非离子型表面活性剂而言，电解质的加入可以使形成的胶束发生氢键断裂，导致脱水，减小凝聚相体积，并改变主体水相的密度而影响分相速度，从而使浊点温度降低，表面活性剂分子沉降发生相分离。氯化钠易溶解，它的加入使Triton X-100 体系在低温下即能完成相分离。但是当NaCl 的加入量接近饱和溶液时，继续增大氯化钠的量对萃取率无影响。所以，实验中所用离子强度为3.4 mol/L。

图2 各因素对DPPH·清除率的影响Fig.2 Effects of various factors on DPPH· scavenging rate

由图2D 可知，随着表活浓度的增大，DPPH·的清除率增大，40 g/L 时达最大;继续增大表活浓度，反而会使DPPH·清除率显著降低，当表活浓度达到55 g/L 时，DPPH·的清除率降低到40%。这可能是由于Triton X-100 的浓度大小不仅决定萃取分离的效果，而且决定富集胶束相体积的大小，同时影响分相过程。浊点萃取率随表面活性剂中官能团的种类和数量的增多而增大，随溶液的粘度的增大而减小，当表活浓度＜40 g/L 时，前者起主要作用;当表活浓度＞40 g/L 时，后者起主要作用，故表活浓度在40 g/L 时较优。

2.3.2 正交实验 在单因素实验基础上，采用L9(34)正交实验，筛选最佳提取工艺条件，结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2 可知，液固比对清除DPPH·能力影响最大，最后影响因素是表活浓度。最优组合为A2B2C2D3，即平衡时间30 min，液固比30 ∶1 mL/g，离子强度3.1 mol/L，表活浓度45 g/L。

2.4 CPE 提取物与VC 清除DPPH·能力比较

根据正交实验最优组合的提取条件，提取脱脂月见草子中抗氧化活性物质，定容至10 mL 的容量瓶中，分别稀释样品溶液质量浓度至0，0.33，0.67，1.33，2，2.67，4，8，10 mg/mL，测定吸光度，每组浓度都进行3 次平行实验，求取平均值并计算自由基清除率。精密称取10 mg VC 定容至10 mL，分别稀释至质量浓度为0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04，0.06，0.10 mg/mL，按上述方法进行测定。

不同浓度CPE 提取物与VC 清除DPPH·能力见图3。

由图3 可知，DPPH·清除率随着溶液浓度的增加而提高，当DPPH·清除率达到1/2 时，待测样品半抑制浓度(IC50)为1.065 mg/mL，VC 溶液的IC50为0.017 mg/mL。可见脱脂月见草子CPE 提取物有较好的抗氧化活性，与强抗氧化剂VC 相比有一定差距，抗氧化成分仍需后续分离纯化。

图3 不同质量浓度VC 和CPE 提取物溶液对DPPH·清除率Fig.3 DPPH· scavenging rate of different concentrations of VC and CPE extracts

3 结论

优化浊点萃取法对脱脂月见草子中抗氧化活性物质的最佳提取工艺条件为:表面活性剂类型Triton X-100、平衡时间30 min，液固比30 ∶1 mL/g，氯化钠摩尔浓度3.1 mol/L，表面活性剂质量浓度45 g/L。CPE 提取物的IC50值为1.065 mg/mL，具有良好的抗氧化性，将其应用于化妆品、食品或药品相关领域具有较大的潜力。

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