HPLC- PAD 法同时测定维药祖卡木颗粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量

买买提·吐尔逊，古丽巴哈尔·达吾提，陈娟，麦麦提江·热麦提

(1.喀什大学 化学与环境科学学院，新疆 喀什 844000;2.新疆特色药食用植物资源化学实验室，新疆 喀什 844000)

维吾尔药祖卡木(Zukamu Granules )颗粒是由山奈、大枣、甘草、睡莲花、洋甘菊、蜀葵子、薄荷、大黄、破布木果、罂粟壳十种新疆维吾尔天然药材组成的，采用维吾尔传统制药工艺，并结合现代制药工艺生产的口服颗粒制剂。该制剂能够调节异常气质，清热、发汗、通窍，可用于治疗感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕等病症［1］。据古代维吾尔医籍记载，该处方至今已有1500 多年历史。研究表明，组成该处方药的山奈、大枣、甘草、大黄等都含有黄酮类成分，祖卡木颗粒的抗病毒作用，与其所含有的黄酮类化合物有密切的联系。目前，对祖卡木颗粒中总蒽醌、总黄酮、罂粟碱含量的测定有研究报道，尚未见用高效液相色谱方法同时分离测定祖卡木颗粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的相关报道。本文以新疆维吾尔药业有限公司和新疆齐康哈博维药有限公司生产的各4 批次祖卡木颗粒为研究对象，提取该颗粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚，建立用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定祖卡木颗粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的方法。以期为祖卡木颗粒的进一步研究和质量分析提供一定的参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

甘草苷对照品(编号:111610-201005)、柚皮苷对照品(编号:110722-200610)、槲皮素对照品(编号:100081-200907)、山奈酚对照品(编号:110861-200808)均来自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈均为色谱纯;乙醇、磷酸均为分析纯;水为高纯水;祖卡木颗粒，2013 年和2014 年分5 批采购于喀什及乌鲁木齐各大医院药房。

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪;KQ3200DE 型超声波清洗器;XA-1 型多功能粉碎机;ZK-82B 真空干燥箱;赛多利斯BS224S 型电子天平。

1.2 色谱条件

色谱柱安捷伦HC-C18 柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，流动相乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长286 nm，365 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL 。

1.3 对照品溶液的配制

准确称取甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚对照品各10.0 mg 置于50 mL 容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，摇匀，得200 μg/mL 甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚对照品标准储备溶液。使用时根据需要混合并稀释至所需浓度。

混合标准溶液的配制:分别准确吸取不同体积甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚标准储备液于7 个10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(5 ℃)。7 组混合标准溶液的浓度(μg/mL)见表1。

表1 混合标准溶液中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的浓度(μg/mL)Table 1 Concentrations of liquiritin，naringin，quercetin and kaempferol in mixed standard solution

1.4 样品溶液的制备

取不同厂家不同批次祖卡木颗粒，分别研细并过60 目筛，准确称取粉末1.0 g，用50% 甲醇(50 mL)浸泡2 h 后，超声提取20 min，使其完全溶解，再次超声10 min，过滤，并用纯甲醇冲洗滤纸，减压蒸馏至近干，用甲醇定容至25 mL，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液置于冰箱备用。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

从二极管阵列检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为286 nm 时甘草苷和柚皮苷都有比较强的吸收，而槲皮素和山奈酚吸收较弱。当检测波长为365 nm时槲皮素和山奈酚都有较强吸收，而甘草苷和柚皮苷吸收很弱或无吸收。因此，结合相关文献［2-3］确定286 nm (甘草苷、柚皮苷)和365 nm (槲皮素、山奈酚)作为检测波长。

2.2 流动相的选择

分别采用不同比例的甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸、乙腈/磷酸溶液为流动相［4］，对样品的分离情况进行考察，当乙腈(A)/0.1%磷酸(B)按下列程序进行梯度洗脱时，甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚与其他杂质峰得到了良好的分离，基线漂移得到了解决，峰形良好。洗脱程序见表2。

表2 洗脱程序Table 2 Elution profile of gradient steps

2.3 提取溶剂及提取方法的选择

考察了乙醇热回流索氏提取法、乙醇超声波提取法、甲醇24 h 浸泡法和甲醇超声波提取法［5-6］。结果表明，用50% 甲醇浸泡2 h 后，超声20 min，放置10 min，再次超声10 min 的方法对甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取率相对最高，在相同的色谱条件下峰面积最大。而且超声波提取法操作简便、提取率高。故选择用50% 甲醇浸泡2 h，超声20 min，放置10 min，再次超声10 min 作为提取溶剂和提取方法。

2.4 线性关系和精密度实验

分别精密吸取7 组混合标准系列溶液20 μL，从低浓度到高浓度按色谱条件测定其峰面积，每一组重复3 次，以对照品浓度c(μg/mL)为横坐标，峰面积A 为纵坐标，进行线性回归，得到的线性回归方程、相关系数、线性范围见表3。

表3 线性回归方程、相关系数、线性范围Table 3 Linearity between peak area and concentration

对上述7 组混合标准系列溶液中选用甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的浓度为1.0，5.0，5.0，5.0 μg/mL的溶液进行了3 次重复测定，每1 次进样量为20 μL，结果甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的RSD 分别为2.51%，1.84%，2.07%，1.21%。

图1 混合标准溶液(A，B)及样品溶液(A* ，B* )色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A，B)and samples (A* ，B* )

用乙腈(A)/0.1%磷酸(B)进行梯度洗脱时，样品中各组分的色谱峰分离度良好，当选择波长为286 nm 时，甘草苷、柚皮苷的峰面积最大(见图A 和A*)。而槲皮素和山奈酚在286 nm 处吸收很弱，因此，选用365 nm 作为槲皮素和山奈酚的检测波长。此时，槲皮素和山奈酚的峰面积最大(见图B 和B*)。

2.5 稳定性实验

取供试品溶液，在12 h 内每隔2 h 进样一次，进样量20 μL，测定甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的峰面积的相对标准偏差分别为1.18%，1.43%，1.98%，2.06%。结果表明，供试品溶液在12 h 内基本稳定。

2.6 加标回收率实验

准确称取已知甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的祖卡木颗粒样品5 份，每份1 g 左右，分别添加不同量的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚标准溶液，按照1.4 节方法制备加标样品溶液，按规定的色谱条件进行测定，测定结果见表4。其平均回收率为甘草苷102.8%，柚皮苷97.3%，槲皮素103.6%，山奈酚101.4%。

表4 方法的回收率和精密度Table 4 Recovery and precision of the method

2.7 样品含量测定结果

精密吸取不同批次不同厂家生产的祖卡木颗粒样品溶液20 μL 进样，并按1.2 节色谱条件进行测定，按外标法计算样品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量，测定结果见表5。

表5 样品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的测定结果Table 5 Determination results of samples

由表5 可知，样品2 不同批次的药品溶液中甘草苷的含量普遍较高，而样品1 中柚皮苷、槲皮素、山奈酚的含量普遍高于样品2。

3 结论

甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚是祖卡木颗粒中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用，本文对样品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取方法及色谱条件进行了研究，用反相高效液相色谱-二极管阵列检测法对不同厂家生产的祖卡木颗粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量进行了测定。结果表明，在同一厂家生产的不同批次样品中个体差异很小，而不同厂家生产的药品中上述四种成分的含量有一定差异，可能是因为投料比和原料来源引起的差异。同时对方法的精密度、稳定性及加标回收率等进行了考察，结果表明该方法简便、准确、可靠，适于测定祖卡木颗粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999:175.

［2］ 许栋明，程可建.RP-HPLC 同时测定温胆汤中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷和甘草酸［J］.中国中药杂志，2011，36(1):45-47.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2010 版.第一部.北京:中国医药科技出版社，2010:1081.

［4］ 谢强胜，王坤，尹宁宁.RP-HPLC 法测定橘红丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷和迷迭香酸［J］.中成药，2011，33(12):2085-2088.

［5］ 陈晨，张兴旺，罗智敏，等.RP-HPLC 法测定不同地区金露梅中槲皮素和山奈酚［J］.分析试验室，2009，28(12):54-56.

［6］ 张丽贤，周光明，姜兰芳，等.非离子表面活性剂萃取-高效液相色谱法测定枇杷叶中的绿原酸、槲皮素和山奈酚［J］.食品科学，2012，33(6):150-153.