琼脂糖—纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性

杨祖伟　邓月新

摘要：用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行测定，在检测酶浓度单位在2000～10000U/ml时呈现很好的2次曲线关系，蚓激酶浓度单位-两垂直直径的乘积回归方程为y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相关系数r2=0.9993。本法回收率范围在89.53%～100.75%，平均回收率为94.7%，RSD为4.2%。

关键词：琼脂糖；纤维蛋白；纳豆激酶；蚓激酶；平板法。

Activities of Nattokinase（NK）in Natto Freeze-dried Powder was Assessed by Agar-fibrin Plate Assay

YANG Zu-wei，DENG Yue-xin

（By-Health Co.Ltd，Zhuhai 519040，Guangdong 519040，China）

Abstract：The activities of Nattokinase（NK）in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。

Key words：Agarose； Fibrin； Nattokinase； Lumbrokinase； Plate method

纳豆（Natto）是，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis var.natto）发酵而成。纳豆激酶（Nattokinase，NK）是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有强烈溶栓功效，实验研究证实该酶，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用，成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生化药物[1，2]。测定纳豆激酶活力的方法主要有琼脂糖-纤维蛋白平板法[3]、纤维蛋白块溶解时间法[4]、四肽底物法[5]、血清板法[6]和酶联反应吸附法[7]等。目前琼脂糖-纤维蛋白平板法是目前用的比较多的一种方法，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联纤维蛋白为底物，酶活与溶解圈面积成线性关系，故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活性。

本文用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行了测定，并对该法的线性关系，重现性，回收率进行了考察。

1资料与方法

1.1一般资料 生化培养箱，分析天平，打孔器（2mm），游标卡尺，pH计，恒温水浴锅，琼脂糖，塑料培养皿（直径14cm），牛纤维蛋白原（牛血）、取凝血酶（牛血）、蚓激酶标准品均来自中国食品药品检定所。

1.2试剂配制 工作溶液：取十二水磷酸氢二钠0.716g和氯化钠1.8g，加水溶解并稀释至200ml，此为A液；取二水磷酸二氢钠0.156g，加水溶解并稀释至100ml，此为B液，将A、B两液混合至pH7.8。1.5%琼脂糖溶液：取琼脂糖0.6g，加工作溶液40ml，加热溶解，置55℃水浴中保温。纤维蛋白原液：取牛纤维蛋白原（牛血）60mg，加工作溶液40ml溶解，在37℃水浴中保温。凝血酶溶液：取凝血酶（牛血），加适量工作溶液制成每1ml中含6 BP单位的溶液。蚓激酶标准溶液：取蚓激酶标准品分别制成为每1ml中含2000、4000、6000、8000、10000U蚓激酶的标准溶液。

2实验方法

2.1标准曲线的绘制 将在55℃保温的1.5%琼脂糖溶液40ml加入在37℃水浴中保温的纤维蛋白原液40ml中，边摇匀边加入，再立即加入凝血酶溶液1ml，立即混匀，快速倒入直径14cm的塑料培养皿中（尽量不产生气泡），室温水平放置1h，打孔，吸干加样孔里渗出的水，精密吸取蚓激酶标准品溶液10μl，点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温培养箱中，反应18h后取出，用游标卡尺测量溶圈两垂直直径。以蚓激酶标准品的单位数为横坐标，蚓激酶标准品溶圈两垂直直径的乘积为纵坐标，得标准2次曲线回归方程。

2.2样品纳豆激酶含量测定 测定6批纳豆冻干粉，分别称取0.5g，加工作溶液定容至10ml，混匀。精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。取10μl供试品溶液按2.1项的方法测定，将供试品溶圈两垂直直径的乘积代入标准2次曲线回归方程，计算供试品效价单位数。

2.3重现性实验 称取同一批次的纳豆冻干粉5份，按照2.1项和2.2项下的方法进行操作，考察操作方法的重现性。

2.4回收率测定 称取纳豆冻干粉1g，共9份，分三组，每组三份，分别加工作溶液定容至10ml，混匀。分别精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。对每组分别进行80%、100%、120%做加标回收。按2.1项的方法进行测定。

3结果与分析

3.1标准曲线的绘制及回归方程的建立 蚓激酶浓度单位-两垂直直径的乘积回归方程为y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相关系数r2=0.9993，所以用该方法测定纳豆提取物中纳豆激酶的活性，在检测酶浓度单位在2000～10000U/ml呈现很好的线性关系。

图1 标准曲线及回归方程

3.2样品含量测定 见表1。

3.3重现性实验 为考擦上述方法的可行性，设计重现性实验，见表2，RSD为3.4%，说明用此方法具有较好的精密性。

3.4加标回收测定 按2.5所述的方法测得纳豆激酶加标回收率的结果见表3，分析表中数据可得，回收率范围在89.53%～100.75%，平均回收率为94.7%，RSD为4.2%，说明该方法具有较高的回收水平。

4结论

琼脂糖-纤维蛋白平板法直接以引激酶活性表示其测定值，简便直观，2次曲线关系关系良好，回收率在89.53%～100.75%。由以上实验数据也表明该法准确度也比较高，适用于纳豆激酶的活性测定。在处理数据中笔者发现酶活力与溶圈面积、酶活力的对数与溶圈面积、酶活力的对数与溶圈面积的对数均不呈现很好的线性关系，会导致结果的准确度降低，而在一定浓度范围内，酶活力与溶圈两垂直直径的乘积呈现很好的2次曲线关系，因此采用2次曲线方程可以很好的提高结果的准确度。

参考文献：

[1]程守强，梁凤来，王仁静，等.纳豆激酶的研究进展[J].微生物学杂志，2005，25（2）：69.

[2]Sumi H，Hamada H，Nakanishi K，et al.Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of Nattokinase[J].Acta Haematol，1990，84（3）：139-143.

[3]Sumi，H.，H.Hamada，&H.Tsushima，et al.A novel fibri2 nolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto：atypical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Expe-rientia，1987，43：1 110-1 111.

[4]Sumi Hiroyuki， Nakajima Nobuka， Tase Naoto.The method of determination of the thrombolytic enzyme nattokinase[J].J.Brew Soc Japan，1993，88：482-486.

[5]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（Nattokinase）in the vegetable cheese natto，a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

[6]Hara T，Tadokoro Y，Satoyama T.A simple，easy and routine assay of fibrinolytic enzyme activity[J].Jpn.Soi.Food Sci.Tech.，1996，43（2）：172-175.

[7]Yuki Y，Nakagawa T，Fujita M，et al.A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for natto[J].Biosci.Biotech Biochem，1994，58（2）：366-370.

编辑/许言