沙棘抗氧化片对小鼠的抗氧化作用

杨黎彬 贾敏 刘少静 刁颖博 张玉琪 肖秋茹

自由基学说表明人体的许多疾病和衰老与氧自由基作用有关，氧化反应与人体健康密切相关，多种疾病都是由于人体氧化反应导致［1］。现代医学研究表明随着年龄的增长，抗氧化酶类活性下降，体内过量的自由基就会引起脂质过氧化，影响细胞功能，进而导致疾病和衰老［2］。通过获取天然抗氧剂来应对自由基的损伤是一条重要的途径，食用功能性的抗氧化功能食品是极为方便有效的补充内源性抗氧化剂的方法。本研究的沙棘抗氧化片由沙棘提取物与葡萄籽提取物以一定比例混合加入相应的辅料压片制成，具有纯度高的优点，并且沙棘中的黄酮类、多酚类成分及维生素等成分与葡萄籽中的原花青素成分共同作用能达到较好的抗氧化保健功效。本研究的目的是探讨沙棘抗氧化片的体内抗氧化作用。本研究参照中国食品药品监督管理局2012年发布的抗氧化功能评价方法［3］，以乙醇诱导的氧化损伤小鼠模型进行小鼠体内抗氧化功能的研究，从小鼠血浆及肝组织的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性、GSH的含量和脂质过氧化产物MDA的含量几个方面验证沙棘抗氧化片的抗氧化功效，为其进一步开发保健食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品 沙棘抗氧化片由西安医学院药学院自制，批号20120518。临用前沙棘抗氧化片磨粉，蒸馏水溶解，配制成所需浓度，4℃保存，给药前水浴加热至37℃。

1.2 动物 昆明种小鼠50只，体重为25～30 g，雌雄各25只，由第四军医大学动物中心提供，合格证号:SCXK(陕)2007-007。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器:ELx808型酶标仪(美国 BioTek公司)，722型分光分度计(上海第三分析仪器厂)，微量加样器(德国Eppendorf公司)，YQ-3型电动匀浆机(金坛市文化仪器有限公司)，KY91旋涡振荡器(北京凯云仪科技有限公司)，GL-25M高速冷冻离心机(上海泸湘仪离心机有限公司)。

1.3.2 试剂:冰醋酸，95%乙醇，氯仿，磷酸盐缓冲液等;还原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组:取8周龄小鼠，体重25～30 g，随机分成5组，每组10只，设为空白对照组、模型对照组、样品低剂量组、样品中剂量组、样品高剂量组。

1.4.2 动物造模及饲养:模型对照组和3个受试样品剂量组按相当于人体推荐量的5、10、20倍的剂量灌胃，即 0.192 g/kg、0.383 g/kg、0.766 g/kg。空白和模型对照组灌服等量的蒸馏水。连续灌胃30 d，每周记录食量及体重。动物房温度保持在(24.0±0.5)℃，相对湿度保持在(65±5)%。室内照明包括光明与黑暗的12 h交替。末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16 h(过夜)，然后1次性灌胃给予50%乙醇12 ml/kg，6 h后取材(空白对照组不作处理，不禁食取材)［15］。

1.4.3 动物血液及肝组织的采集:在饲养结束时，小鼠用乙醚麻醉，解剖收集血液并取肝组织。各组称取适量肝脏组织，加入9倍体积的预冷匀浆缓冲液(根据所测指标选择0.9%氯化钠溶液或特殊缓冲液)，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液电动匀浆(1 500 r/min，2 min)，3 000 r/m 离心15 min，上清液分装后 －80℃保存备用。

1.4.4 指标测定:血清和肝脏组织中MDA含量用TBA比色法测定，SOD活性用羟胺法测定，GSH、GSHPx用5，5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)法测定。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，独立样体t检验，组间显著性采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沙棘抗氧化片对乙醇导致的氧化损伤模型小鼠血清中和肝脏组织匀浆中MDA和GSH的影响 模型组小鼠血清与肝脏组织的MDA含量与空白对照组相比显著升高，GSH含量与空白对照组相比显著降低，说明建模成功。样品中、高剂量组小鼠血清和肝组织中MDA含量显著低于模型对照组(P＜0.05或＜0.01)，GSH含量显著高于模型对照组(P＜0.05或＜0.01)。说明沙棘抗氧化片中、高剂量可以很好地保护小鼠体内清除过氧化物的能力。见表1。

表1 沙棘抗氧化片对血清中和肝脏组织匀浆中MDA和GSH的影响n=10，±s

表1 沙棘抗氧化片对血清中和肝脏组织匀浆中MDA和GSH的影响n=10，±s

注:与空白对照组比较，*P ＜0.01;与模型对照组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别MDA血清中(nmol/ml) 肝组织匀浆中(nmol/mg-Protein)GSH(mgGSH/Lg-Protein)血清中(nmol/ml) 肝组织匀浆中(nmol/mg-Protein)空白对照组5.83 ±1.81 4.58 ±1.88 6.58 ±2.28 4.62 ±1.28模型对照组 8.81 ±2.34* 6.67 ±1.72* 3.57 ±1.19* 3.26 ±0.73*样品低剂量组 6.39±2.84 3.34±1.61△ 4.12±1.51 4.50±1.99#样品中剂量组 6.41±3.05# 3.39±1.21△ 5.91±2.74△ 5.63±2.13△样品高剂量组 5.89±2.20△ 3.44±1.84# 5.93±2.03△ 5.58±2.02△

2.2 沙棘抗氧化片对乙醇导致的氧化损伤模型小鼠血清中和肝脏组织匀浆中SOD和GSH-PX活性的影响 与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清与肝脏组织的SOD和GSH-Px活性显著降低，说明建模成功。经口给予小鼠沙棘抗氧化片30 d，与模型对照组相比，高剂量组小鼠血清和肝组织中SOD和GSH-Px活性显著高于模型对照组(P＜0.05或＜0.01)。说明沙棘抗氧化片可以起到抗氧化的作用，能有效地保护小鼠机体。见表2。

表2 沙棘抗氧化片对血清中和肝脏组织匀浆中SOD和GSH-PX活性的影响n=10，±s

表2 沙棘抗氧化片对血清中和肝脏组织匀浆中SOD和GSH-PX活性的影响n=10，±s

注:与空白对照组比较，*P ＜0.01;与模型对照组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 SOD(U/mg-Protein)血清中 肝组织匀浆中GSH-PX(活力单位)血清中 肝组织匀浆中空白对照组 39.00 ±5.74 581.05 ±117.99 464.06 ±11.85 1887.25 ±354.71模型对照组 31.33 ±6.82 435.17 ±126.20* 325.38 ±82.10* 1 426.15 ±325.79*样品低剂量组 33.82 ±7.12 475.45 ±115.74 366.93 ±143.26 1 407.22 ±445.47样品中剂量组 37.52 ±5.85# 549.69 ±142.48# 396.15 ±82.42# 1 624.52 ±703.21样品高剂量组 40.36 ±6.83△ 567.47 ±134.49# 452.31 ±103.78△ 1 922.69 ±500.33△

3 讨论

沙棘是生长在我国华北、西北和东北地区的一种野生落叶灌木，富含生物活性物质。研究表明沙棘富含以异鼠李素、槲皮素、山柰酚为母核，糖元为葡萄糖、鼠李糖、槐糖等的黄酮类化合物，现已从沙棘植物中分离到49种黄酮类化合物［4］。沙棘中含有三十余种包括没食子酸、儿茶素为母核的多酚类化合物，这些多酚类化合物具有抗氧化、保护细胞、保护心脏及促进伤口愈合等作用［5］。沙棘有维生素“源”植物的美称，富含维生素C、E。黄酮类、多酚类化学成分及维生素C、E等成分具有较强的抗氧化作用［6］。实验证明沙棘具有很强的抗氧化活性［7－10］。葡萄籽提取物的主要功能成分是原花青素，原花青素含有大量的活性酚羟基，是氢的供体，能有效地清除多种活性氧自由基，影响某些酶的生物活性，具有极强的抗氧化活性。国内外各种体外试验及动物实验研究证实葡萄籽提取物原花色素具有很强的抗氧化活性，是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，可对氧化损伤起到保护作用，且其保护作用优于其他抗氧化剂［11－15］。以沙棘为主要原料开发的保健食品众多，但目前获得国家食品药品监督管理总局批准的有抗氧化功效的保健食品仅有极少数几种，这类产品具有较大的开发空间。另外，这类产品组方多为沙棘与有抗氧化功效的中药配伍，存在纯度低、服用量大的问题。

正常情况下，体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态。当自由基产生过多或通过内源性的抗氧化成分对自由基清除减少，如SOD和GSH-Px活性降低，体内氧自由基代谢就会出现失衡，造成自由基过剩。过量自由基可通过过氧化作用攻击细胞膜及核酸、蛋白质和酶类等生物大分子，造成生物膜的结构损伤和功能障碍，DNA基因突变或复制异常及生物酶活力下降，最终导致细胞功能严重受损以至衰老、死亡［16］。随着年龄的增长，机体内自由基防御系统如SOD、GSH-Px等活性下降，这种平衡逐渐被破坏。MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量可间接判断体内自由基对机体的损伤程度以及衰老的程度与脂蛋白交联有毒性作用，其水平高低能直接反应脂质过氧化程度以及机体的抗氧化能力。测定血清中MDA含量，可以间接反映细胞受氧化损伤的程度［17］。机体抗氧化防御体系中 SOD对氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD能及时清除机体生成的过量自由基，从而保护细胞免受氧自由基的攻击，因而SOD活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力［18］。GSH-Px是机体广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它能催化GSH变为氧化型谷胱甘肽GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害［19］。GSH是一种由3个氨基酸组成的小分子肽，它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。因此，测定血清中GSH-Px和SOD的活性，以及MDA、GSH含量，可以间接反映机体清除自由基的能力，观察体内的氧化损伤情况。

本实验利用乙醇诱导的氧化损伤小鼠模型，与空白对照组相比，模型对照组小鼠抗氧化指标差异显著(P＜0.01)，说明该方法建立的小鼠氧化损伤模型效果良好，可应用于抗氧化实验。本实验中喂服沙棘抗氧化片的中、高剂量组小鼠与模型对照组小鼠比较，血清和肝组织中MDA水平均显著降低，SOD和GSH-Px活性显著升高，抗氧化物质GSH含量显著增加，表明沙棘抗氧化片具有较好的抗氧化功能，具有进一步开发为保健食品的价值。

1 赵克默主编.氧自由基与临床.第1版.北京:中国医药科技出版社，2000.

2 赵宝路主编.氧自由基和天然抗氧化剂.第1版.北京:科学出版社，1999.

3 关于印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法的通知.国食药监保化［2012］107号.

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