实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)C57BL/6J小鼠模型构建

黄夏冰 康巧珍 王晓东 丁聪 江慧 刘诗梦 刘鑫

(郑州大学生命科学学院 河南郑州 450001)

多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是一种慢性中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤的自身免疫疾病，成年人中最为常见，平均发病年龄为20～40岁［1－2］。MS的发病原因至今还不清楚，有研究表明，可能是多种基因与环境的相互作用导致疾病的发生［3］。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠是研究 MS的经典动物模型，由自身抗原特异性T细胞介导自身免疫疾病，在临床表征和病理特征上与MS极为相似。目前EAE的诱导方法可分为主动诱导法和被动诱导法。主动诱导法主要是通过皮下注射特定的髓鞘蛋白或其特定肽段加完全弗氏佐剂免疫小鼠;被动诱导法是通过转移已致敏的CD4+T细胞进行过继免疫诱导。通过选择动物品种和品系及不同的抗原和免疫方法，可诱导出慢性不复发、复发－缓解型和继发进展型EAE模型，用于模拟不同的MS疾病类型。例如，用髓鞘碱性蛋白MBP89－101免疫SJL/J小鼠构建急性非复发型EAE模型，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35－55免疫C57BL/6J构建慢性非缓解型EAE模型，用髓鞘脂蛋白PLP139－151免疫SJL/J小鼠构建复发 －缓解型EAE模型［4－6］。

MOG35－55免疫C57BL/6J小鼠构建的EAE模型在病程上表现为急性发作、不缓解的慢性过程。其发病的过程为:皮下注射的 MOG35－55刺激系统性免疫应答，自身抗原特异性T细胞在外周淋巴器官扩增后迁移到中枢神经系统外围与髓鞘蛋白再次相遇，形成大量的抗原特异性T细胞，穿过血脑屏障，最后进入中枢神经系统，导致脱髓鞘损伤［7］。本实验通过MOG35－55免疫 C57BL/6J小鼠建立主动免疫性的慢性－非缓解的EAE模型，旨在为以后研究MS的发病机制和治疗方法奠定基础。

1 材料方法

1．1 材料与试剂 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35－55多肽(上海科肽生物技术有限公司合成，纯度＞95%)，百日咳毒素购自于美国Sigma公司，含有10 mg/ml结核分枝杆菌的完全弗氏完全佐剂购自美国Chondrex公司。

1．2 实验动物 SPF级雌性8～10周C57BL/6J小鼠(16～20 g)，购自北京维通利华公司，所有小鼠在相同环境下喂养，饲养环境温度20～25℃。饲养以及实验过程符合《实验室动物饲养和使用条例》。

1．3 EAE模型的建立 C57BL/6J小鼠随机分为EAE组和对照组，各5只。MOG35－55多肽用PBS稀释后与完全弗氏佐剂等体积混合，用一次性三通管连接固定玻璃注射器在冰上反复吹打30 min以上，最终制成油包水的乳化剂。EAE组每只小鼠注射含有MOG35－55多肽300 μg 的0．2 ml乳化剂(结核分枝杆菌的终浓度为4 mg/ml)。在免疫后0 h和48 h腹腔注射百日咳稀释液(0．1 ml，200 ng/只)。对照组注射等量生理盐水。

1．4 EAE小鼠体质量监测及神经功能评分 自免疫当天开始，每天观察小鼠的摄食情况、小鼠体质量变化。从初次免疫至第32天实验终止前，采用双盲法，每天2人至少1次在同一时间按Benson评分标准对EAE的严重性进行临床评估。评分标准如下:0分，正常;1分，尾部无力或蹒跚步态伴尾巴有力;2分，蹒跚步态伴尾巴无力(共济失调);2．5分，共济失调伴部分单肢麻痹;3分，单肢完全麻痹;3．5分，单肢完全麻痹并伴随另一肢体部分麻痹;4分，双肢完全麻痹;4．5分，四肢麻痹;5分，死亡。

1．5 病理组织学检测 在EAE小鼠发病的高峰期进行取样:将小鼠注射戊巴比妥钠盐麻醉后，用4%的多聚甲醛进行心脏灌流。取出小鼠的大脑和脊髓置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蜡包埋后制成6μm厚切片后进行常规H＆E染色，于倒置显微镜下观察病理学组织形态。

2 结果

2．1 EAE小鼠的行为及神经功能评分 C57BL/6J EAE小鼠发病表现为活动少，进食少，体质量明显下降。临床症状为尾部松弛无力，步态蹒跚，双后肢依次呈现麻痹状态，行动困难，且临床评分随着时间延长加重，见图1。大多发病小鼠症状无缓解，但是有小部分小鼠症状稍微减轻。EAE组小鼠从免疫后第16天开始陆续发病，至第20天5只小鼠均发病，平均发病时间为(17．6 ±2．19)d，最高评分可达(2．7 ±0．57)分。对照组小鼠未出现神经系统症状，食欲无变化，体质量持续增加，Benson评分为0分。

图1 EAE小鼠临床行为打分

2．2 EAE小鼠病理组织学检测 EAE组小鼠脑和脊髓实质中均有大量炎性细胞浸润，在脊髓腰膨大区更为明显，表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，并且脑组织小血管周围形成血管袖套样浸润。对照组小鼠脑和脊髓均未见明显异常改变。见图2、3。

图2 EAE小鼠脊髓病理学切片

图3 EAE小鼠脑组织病理学切片

3 讨论

MS是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统自身免疫疾病。EAE是一种由致敏性CD4+T细胞诱导产生的，在临床表征和病理特征上与MS极为相似的自身免疫性疾病模型［8］。动物疾病模型的建立对疾病的发病机制、临床诊断、治疗以及各种靶分子的检测具有重要意义，制备理想的、成熟的动物模型是研究人类疾病的重要手段和前提。

本研究采用免疫原MOG35－55诱导C57BL/6J小鼠建立EAE模型。将MOG35－55与完全弗氏佐剂混匀，充分乳化有利于延长抗原在体内的残留时间，为诱发免疫反应提供充分的机会。随后采用腹腔注射百日咳毒素改善炎性细胞进入中枢神经系统的血脑屏障的阻力，有利于模型的成功构建。采用以上方式免疫C57BL/6J小鼠诱发EAE，具有模型稳定，发病率高的特点。随后，对EAE小鼠的脊髓、脑组织进行病理学检测，发现与对照组小鼠相比，EAE小鼠的脊髓、脑组织中有大量的炎性细胞浸润，在脊髓的腰膨大区更为显著，并且在小血管周围有袖套样淋巴细胞浸润。

本研究用MOG35－55免疫C57BL/6J，稳定地构建了EAE小鼠模型，为研究MS的发病机制、筛选有效的治疗药物奠定了基础。

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