EphB4和EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤中的表达及其意义

张 坚

·论著·

EphB4和EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤中的表达及其意义

张 坚

目的 探讨人视网膜母细胞瘤组织中EphB4和EphrinB2蛋白的表达水平及其临床意义。方法 选取10例正常人视网膜组织(正常组)及47例视网膜母细胞瘤组织标本(病例组)，采用免疫组化法检测两组EphB4和EphrinB2蛋白的表达水平，并分析二者的表达与视网膜母细胞瘤患者临床病理特征的关系。结果 病例组EphB4蛋白、EphrinB2蛋白阳性表达率均显著高于正常组(P<0.01)。EphB4与EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤组织标本的阳性表达均与临床分期、分化程度及视神经浸润显著相关：临床分期较晚、未分化型、视神经浸润者EphB4与EphrinB2蛋白阳性细胞比例高于临床分期较早、分化型及视神经未浸润者(P<0.05，P<0.01)。结论 EphB4和EphrinB2蛋白可作为视网膜母细胞瘤恶性程度及视神经浸润程度的预测指标。

视网膜母细胞瘤；EphB4蛋白；EphrinB2蛋白；基因表达调控,肿瘤

视网膜母细胞瘤是目前眼科常见的根发于胚胎型视网膜细胞的恶性肿瘤之一，同时也是幼龄群体中眼内最常见和最严重的恶性肿瘤[1]。分子生物学的不断发展和各种分子治疗方法的日趋成熟，为当前医疗人员在分子水平对视网膜母细胞瘤进行研究和治疗提供了良好的技术和理论条件。生促红素人肝细胞(Eph)激酶作为受体酪氨酸激酶中最大的亚家族，已被查明有8种配体和14种受体，以其基因序列的同源性及与配体Ephrin结合表现，Eph受体分为EphA与EphB两类，而Ephrin配体分为EphrinA与EphrinB 2个亚型[2]。本研究采用免疫组化SP法对10例正常视网膜组织与47例视网膜母细胞瘤标本中EphB4、EphrinB2蛋白的表达水平进行测定，探讨其在视网膜母细胞瘤发生、发展及预后判断等方面的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 以陕西省人民医院病理科1998—2014年收集的47例视网膜母细胞瘤组织(病例组)和10例正常人的视网膜细胞组织(正常组)作为研究对象。病例组男27例，女20例；年龄3个月～9岁，中位年龄4岁；临床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例，Ⅴ期5例；根据视网膜母细胞瘤中是否存在菊形团排列分为分化型20例，未分化型27例；肿瘤细胞浸润视神经25例，未浸润22例。正常组男6例，女4例；年龄6个月～6岁，中位年龄4岁。两组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：视网膜母细胞瘤病理标本均源自陕西省人民医院病理科收集的、经病理检查证实为视网膜母细胞瘤患者；正常标本来自本院健康体检者。排除标准：未经病理学证实为视网膜母细胞瘤的标本，临床分期、分化不明确的标本。

1.2 仪器与试剂 显微镜购自德国Bresser公司，DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科技有限公司，QT-1漩涡混合器购自上海琪特分析仪器有限公司，DK-8D型电热恒温水槽购自上海静宏实验设备有限公司，BCD-241WE冷藏冰冻箱购自青岛海尔公司，2 ml冷存管购自美国IMEC公司，Stratagent Mx3000P荧光定量PCR仪购自上海吉泰生物科技有限公司。

PhB4k抗体、EphrinB2多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，SP免疫组化相关试剂盒购自福州迈新公司，高纯度梯度酒精购自上海化学试剂有限公司，分析纯AR苏木素购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 检测方法 采用SP二步法对组织样本进行免疫组化染色。玻片厚4 μm，采取脱蜡和梯度酒精对组织样本进行水化，然后用高压锅对样本进行热处理5～8 min以对抗原进行修复和PBS冲洗，使用浓度为3%的过氧化氢试液对过氧化物酶进行阻断，用马血清进行封闭后加用一抗，4℃冰箱孵育样本过夜后加生物素标记二抗，在室温下放置30 min后用PBS进行充分洗涤，洗涤结束后加SP复合物对样本孵育20～30 min；用PBS洗3次，每次2 min；用DAB对样本进行显色，然后用苏木素进行复染；最后用自来水冲洗掉样本中返蓝，再用梯度酒精脱水，选择中性树胶进行封片。用PBS代替一抗作阴性对照，而以阳性片作为阳性对照。

1.4 免疫组化结果的判定标准 EphB4和EphrinB2蛋白阳性表达均为细胞膜和细胞浆同时染成黄色或棕褐色，按照着色强度进行分级，无着色：0分；淡黄色：1分；棕黄色：2分，褐色：3分。显微镜下染色阳性细胞计数：1%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。上述两项得分相加为最终评分，-为总分<3分，阴性表达；+为3分，弱阳性表达；++为4分，中阳性表达；+++为5分，强阳性表达[3]。本研究中-为阴性表达，+、++、+++归为阳性表达。

2 结果

2.1 EphB4蛋白、EphrinB2蛋白免疫组化染色阳性表达 病例组EphB4蛋白、EphrinB2蛋白免疫组化染色阳性表达率分别为82.98%(39/47)、76.60%(36/47)，均显著高于正常组的20.00(2/10)%和10.00%(1/10)(P<0.01)。EphB4蛋白、EphrinB2蛋白在正常视网膜细胞中可见，均着色为蓝色，无黄色或棕褐色；EphB4蛋白、EphrinB2蛋白在肿瘤细胞主要表达于细胞胞浆中，少量位于炎性细胞的胞浆中，均呈棕褐色表达。免疫组化染色结果见图1。

图1 EphrinB2、EphB4在正常视网膜细胞及视网膜母细胞瘤细胞中的表达(SP×400)

2.2 不同临床分期的视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较 Ⅳ期+Ⅴ期视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白阳性细胞比例显著高于Ⅰ期+Ⅱ期和Ⅲ期组织标本、Ⅲ期显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05)，见表1。

表1 不同临床分期的视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较

注：与Ⅰ期+Ⅱ期比较,aP<0.05，与Ⅲ期比较,cP<0.05

2.3 不同分化类型视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较 未分化型视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白阳性细胞比例均显著高于分化型组织标本(P<0.01)，见表2。

表2 不同分化类型的视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较

2.4 视神经浸润与否视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较 视神经浸润视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白阳性细胞比例均显著高于视神经未浸润组织标本(P<0.01)，见表3。

表3 视神经浸润与否视网膜母细胞瘤组织标本EphB4、EphrinB2蛋白表达比较

3 讨论

肿瘤的生长、转移过程十分复杂且影响因素较多，肿瘤细胞的增殖和凋亡失衡是引发肿瘤形成与发展的关键性因素。近年来研究表明EphB4与EphrinB2的信号通路和神经系统发育、肿瘤发展、生理病理性血管形成有着密切关系[4-6]，Eph受体及其配体成为世界范围肿瘤研究的热门领域。

有研究证明EphB4于胎盘和一系列原发癌组织以及恶性细胞中呈不同程度的表达[7]。有学者研究发现，EphB4在乳腺癌表达水平呈现下调趋势[8]；在前列腺癌和黑色素瘤中的表达具有差异性[9]。EphrinB2在肺、肾、结肠特别是在肺和结肠上皮细胞中呈高度表达，造成其在肺癌和结肠癌中表达水平有1.7～1.9倍的下调，而其在肝癌和肾癌中表达水平上调[10]。有研究者在体外试验中发现，在恶性结肠肿瘤中EphrinB2的表达水平上调，而在正常结肠壁细胞中其表达水平很低或为零[11]。本研究发现，EphB4与EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤组织标本中阳性细胞比例均明显高于正常人视网膜组织。

国内外关于EphB4与EphrinB2在各种恶性肿瘤中的表达水平及与临床因素的关系存在争议[12]。有学者发现EphB4在头颈鳞状细胞癌细胞转移的淋巴结中具有较高的表达水平；癌症晚期患者和吸烟者的表达水平均高于早期患者和非吸烟者[13]。有学者发现EphB4蛋白的阳性表达率和视网膜母细胞肿瘤的分化程度及视神经浸润程度显著相关[14]。本研究得出类似结果，同时发现EphB4与EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤的阳性表达均与临床分期、分化程度及视神经浸润显著相关：临床分期较晚、未分化型、视神经浸润者EphB4与EphrinB2蛋白阳性细胞比例高于临床分期较早、分化型及视神经未浸润者。表明EphB4和EphrinB2与视网膜母细胞瘤的产生及发展过程密切相关。因此，EphB4和EphrinB2蛋白可作为视网膜母细胞瘤恶性程度及视神经浸润程度的预测指标。

有研究表明，EphB4和EphrinB2蛋白的共表达及它们间的相互作用能够对视网膜母细胞瘤的产生以及发展起十分重要的作用，并且EphB4在和EphrinB2进行配体的过程中被激活，两者通过相互作用在各种组织的发展、肿瘤发生及其供血血管生成等方面起着重要的作用[15-16]。EphrinB2在动脉血管壁细胞、血管周围的间质细胞以及内皮细胞产生特定表达，而EphB4只在属于静脉系统的内皮细胞产生表达[17]，同时EphB4能够对EphrinB2介导细胞迁移起抑制作用，而EphB4的胞外区域可以促进癌细胞生长、肿瘤供血血管生成以及内皮细胞增殖、迁移，这是因为位于肿瘤细胞表面的EphB4与血管上的EphrinB2进行结合，通过相互激活从而促进肿瘤供血血管的生成和肿瘤的生长[18-21]。在EPhrinB-EPhB系统的作用下，肿瘤细胞逐渐生成侵袭性血管，同时调整对视网膜内皮细胞的渗透程度，稳定新生血管[22]。本研究设计存在不足，未对EphB4和EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤中表达的相关性进行验证，有待于在今后的试验中进行深入研究。

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Expression and Significance of EphB4 and EphrinB2 Proteins in Retinoblastoma

ZHANG Jian

(Department of Ophthalmology, the People's Hospital Shaanxi Province, Xi'an 710068， China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of EphB4 and EphrinB2 proteins in human retinoblastoma tumor tissues. Methods A total of 10 cases of normal human retinal tissues (normal group) and 47 samples of retinoblastoma tissues (case group) were recruited in this study. Immunohistochemical assay method was used to detect expression levels of EphB4 and EphrinB2 proteins, and the relationship between the expressions and clinicopathological features was analyzed. Results The positive expression rates of EphB4 and EphrinB2 proteins in case group were significantly higher than those in normal group (P<0.01). The positive expressions of EphB4 and EphrinB2 proteins were significantly correlated with clinical stage, differentiation degree and neuro-optic infiltration. Positive cell ratio of EphB4 and EphrinB2 proteins in patients with later clinical stage, undifferentiated type and infiltrative optic nerve type were significantly higher than those in patients with earlier clinical stage, differentiated type and non-infiltrative optic nerve type (P<0.05,P<0.01). Conclusion Expressions of EphB4 and EphrinB2 proteins can be used as forecasting indicators of malignant degree and damage degree of optic nerve in human retinoblastoma tumor tissues.

Retinoblastoma; EphB4 protein; EphrinB2 protein; Gene expression regulation, neoplastic

陕西省科技研究发展计划项目(2014K11-01-01-23)

710068 西安，陕西省人民医院眼科

R739.72

A

2095-140X(2015)08-0025-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.007

2015-04-13 修回时间：2015-05-23)